4.1.1. Drojdii consumatoare de etanol
Obtinerea biomasei pe diferite substraturi cu ajutorul microorganismelor a fost si este in continuare un capitol important al industriei de biosinteza. Daca la inceput aceasta masa celulara, cunoscuta sub denumirea de "proteine monocelulare" (Single Cell Protein) a fost utilizata in special ca aditiv furajer pentru imbogatirea hranei animalelor in proteine si vitamine, astazi destinatiile ei s-au diversificat. Biomasa microbiana este utilizata ca:[ [1] , [2] , [3] , [4] , [5] , [6] ]:
- biocatalizator pentru obtinerea unor produsi optic activi utilizati in industria de medicamente;
- produse de tip ``aliment-medicament`` pentru uz uman, in special ca normalizator bi ologic (probiotic) al florei intestinale saprofite [ [7] , [8] , [9] , [10] , [11] ];
- aditivi in hrana umana.
- drojdiile sunt utilizate in alimentatia umana de mii de ani, fiind stans legate de istoria civilizatiei umane (paine, vin), atfel incat nu mai trebuie sa depaseasca bariera psihologica ce apare la introducerea in alimentatia/terapia umana a unui nou produs biotehnologic;
- datorita marii adaptabilitati pot utiliza diferite surse de carbon cu randamente de transformare suficient de ridicate pentru a le face atractive ecconomic;
- datorita dimensiunilor mai mari pot fi separate mai usor din mediul biologic in care se dezvolta, fara a necesita aparatura scumpa.
In literatura de specialitate sunt citate numeroase specii de drojdii utilizate (utilizabile) pentru obtinerea de biomasa pe etanol, cele mai multe apartinand genurilor Saccharomyces[ [12] , [13] , [14] , [15] , [16] , [17] , [18] ] si Candida (Candida acidothermophilum, C. ethanothermophilum, C. utilis) [ [19] , [20] , [21] , [22] , [23] , [24] , [25] , [26] ], Hansenula (Hansenula anomala)
Laskin [ [27] ] citeaza drojdii din genurile Candida, Debaromyces, Endomycopsis, Hansenula, Mycoderma, Pichia, Rhodotorula si Saccharomyces pentru care compania Exxon-Nestle a intiat proiecte de dezvoltare a unor procese de obtinere a biomasei pe substrat de etanol.
Hitzman [[28] ] mentioneaza tulpini de drojdii din genurile Candida, Pichia, Hansenula si Torulopsis testate de compania Provesta-Philipps in cursul dezvoltarii unor procese de obtinere a biomasei de drojdie la densitati celulare mari. Principalele criterii de selectie a tulpinilor pentru utilizare industriala s-au referit la obtinerea unor randamente de substrat mari si constante, stabilitatea tulpinii pe parcursul unor bioprocese cu durata mare in timpul carora pot aparea conditii de cultivare adverse determinate de disfunctionalitati ale utilajelor, aparitia contaminarii, etc. Deoarece biomasa obtinuta de firma Provesta-Philipps era destinata utilizarii in alimentatie un continut proteic in jur de 60% reprezenta un parametru esential in alegerea tulpinii producatoare.
4.1.2. Aspecte biochimice ale cresterii drojdiilor pe etanol
Drojdia S.cerevisiae este unul dintre cele mai simple organisme eucariote, cu o marime a genomului doar de trei ori mai mare decat al bacteriei E.coli. Metabolismul acestei drojdii este extrem de adaptabil, ea fiind capabila sa creasca pe o varietate foarte mare de substraturi, in conditii favorabile putand creste in prezenta unor concentratii mari de etanol [ [29] ]
Figura 1 ilustreaza calea metabolica de utilizare a etanolului de catre drojdii, prezentand importanta ciclului glioxilatului pentru metabolizarea etanolului.
In prima etapa, etanolul este oxidat la acetaldehida. Shachar-Nishri si Freeman [ [30] ] prezinta doua cai metabolice prin care poate avea loc aceasta reactie:
1. Reducerea etanolului la acetaldehida cu ajutorul alcool - dehidrogenazei, conform reactiei:
aceasta reactie este specifica drojdiilor S.cerevisiaei, Candida utilis.
2.Oxidarea etanolului la acetaldehida cu ajutorul alcool-oxidazei :
reactie caracteristica speciilor Candida boidinii si Pichia pastoris .
Figura 1. Reactiile biochimice ale ciclului glioxilatului
Acetaldehida formata este oxidata in continuare la acetat. Ca rezultat al acestor oxidari, se produc 2 molecule de NADH pentru fiecare molecula de etanol transformata in acetat. Acetatul produs se poate acumula in mediul extracelular sau poate fi transformat in acetil-CoA, in functie de concentratia de etanol si activitatea metabolica a microorganismului. Acetil-CoA formata intra in ciclul TCA, transformandu-se in malat.
Indiferent de sursa de carbon folosita, drojdiile elimina in mediu oxalilacetat si alti intermediari metabolici. In cazul microorganismelor ce cresc pe substrat C2 (etanol, acetat) alimentarea cu precursori ai acidului oxalilacetic este realizata cu ajutorul enzimelor izocitrat liaza [[31] , [32] ] si malat sintetaza. Actiunea acestor doua enzime cheie permite compusului C2 (acetil-CoA) sa intre intr-un al doilea punct in ciclu, avand drept rezultat sinteza intermediarilor din ciclul TCA (acizilor tricorboxilici). S-a demonstrat ca aceasta cale este controlata de concentratia intracelulara de fosfoenolpiruvat, care inhiba activitatea izocitrat liazei.
Atunci cand singura sursa de carbon disponibila este un compus C2 (acetat sau etanol) este necesara utilizarea ciclului glioxilatului, acesta fiind necesar si suficient pentru reaprovizionarea cu intermediari in timpul cresterii pe etanol. Acest ciclu este supus controlului exercitat asupra sintezei si activitatii izocitratliazei. Desi mecanismele de reglare nu sunt perfect cunoscute, s-a emis ipoteza conform careia atat controlul genetic cat si cel al activitatii enzimatice sunt realizate prin intermediul concentratiei aceluiasi compus: fosfoenolpiruvatul.
Atunci cand sursa de carbon utilizata este un zahar, intermediarii ciclului TCA sunt mentinuti la un nivel suficient astfel incat nu mai este necesara sinteza izocitrat liazei. In cazul unui aport insuficient de fosfoenolpiruvat, va fi derepresata sinteza izocitratliazei, creindu-se astfel posibilitatea utilizarii acetatului (ca produs de metabolism al etanolului)
Un alt mecanism al caii metabolice de utilizare a etanolului de catre drojdii este propus de Humphrey [[33] ], completand teoria anterioara.
O parte din acetil-CoA intra in ciclul TCA si evolueaza direct la malat. In acest caz, cea mai mare parte din NADH citoplasmatic este implicat in oxidarea etanolului astfel incat malatul este transformat mai degraba in piruvat pentru sinteza componentilor celulari si cresterea microorganismului, decat in oxalilacetat care necesita NAD. Pe masura ce concentratia de etanol scade si acetatul extracelular este adus inapoi in celula de o variatie in echilibrul acetatului, mai mult NAD devine disponibil pentru transformarea malatului in oxalilacetat. Astfel o proportie crescuta de acetil CoA trece prin intreg ciclul TCA. Deci la concentratii scazute de etanol si ridicate de acetat, o mai mare parte a substratului este utilizata pentru mentinere, decat pentru cresterea celulara.
Figura 2. Metabolismul celular al etanolului.
De aceea este posibil sa se observe o crestere a coeficientului respirator atata timp cat un procent mare din acetil CoA trece prin tot ciclul, deoarece se produce mai mult CO2 in timp ce consumul de oxigen ramane acelasi. In plus, nivelele de NADH scad o data cu declinul conversiei etanolului si cresterea consumului de acetat extracelular.
Utilizarea etanolului in celula este prezentata Figura 2. Etanolul este oxidat la acetaldehida de catre alcool dehidrogenaza (izoenzima ADH II) [ [34] , [35] , [36] , [37] , [38] ].
Obtinerea etanolului ca produs final al glicolizei si utilizarea acestuia ca sursa de carbon si energie pentru crestere, depind de activitatea acestei enzime [ [39] ]. Izoenzimele ADH din S.cerevisiae reprezinta o familie de enzime NAD dependente, diversificate functional [[40] [41] [42] , [43] , [44] ]. Ele apartin grupului de enzime Zn-dependente prezentand identitate secventiala [ [45] ,[46] , [47] , [48] ].
ADH I, izoenzima fermentativa clasica, localizata in citosol, este responsabila pentru ultima etapa din ciclul glicolitic la drojdii (reducerea acetaldehidei la etanol) [[49] , [50] ]
ADH II, izoenzima oxidativa este represata in conditii fermentative [[51] ] si derepresata in absenta unaui zahar ce poate fi fermentat, cum este glucoza. In celula drojdiilor, ADH II oxideaza etanolul la acetaldehida, intermediar in gluconeogeneza [ [52] ,[53] ]. Enzima este extramitocondriala. ADH 2, gena structurala pentru ADH II este reglata la nivel transcriptional de represia catabolica prin intermediul unui efector pozitiv specific, codificat de gena ADR 1.
Izoenzima ADH III a fost descoperita de Lutsdorf si Megnet [ [54] ]. Este localizata in mitocondrii, fiind prezenta la drojdii crescute pe glucoza sau etanol. Functia metabolica a acestei enzime nu este clar cunoscuta, dar exista indicatii ca nu functioneaza fermentativ: tulpini ce contin doar ADH III nu pot supravietui ca tulpini "petit" care obtin energia doar prin fermentatie. Este posibil ca ADH III sa fie implicata in metabolismul respirator, tinand seama si de localizarea ei mitocondriala.
Genele structurale ADH 1 si ADH 2 care codifica izoenzimele ADH I si ADH II sunt cunoscute si caracterizate [[136], [55]]. La S.cerevisiae au fost identificate inca doua gene ADH: ADH 3 [ [56] , [57] ] care codifica enzima mitocondriala si ADH 4 care nu manifesta nici-un fel de similaritate semnificativa cu celelalte gene ADH [[58] , [59] ].
Urmatoarea etapa in metabolizarea etanolului este oxidarea acetaldehidei la acetat, reactie catalizata de acetaldehid-dehidrogenaza. Au fost izolate doua acetaldehid-dehidrogenaze (ACDH) din S.cerevisiae [ [60] , [61] , [62] ]. Una dintre aceste enzime este localizata in mitocondrii si poate folosi atat NAD + cat si NADP+, fiind activata de K+ si de diversi tioli [[63] , [64] , [65] ]. Cea de-a doua enzima este activata de Mg2+, este NADP+ dependenta si este localizata in citosol [ [66] , [67] , [68] ].
Cercetarile experimentale au demonstrat ca enzima mitocondiala are un rol important in cresterea drojdiei pe etanol; mutantele ce nu au aceasta enzima nu cresc pe etanol [ [69] ]. Enzima citosolica pare a fi implicata in sintetizarea acetil-CoA din acetaldehida produsa de PDC in cazul cresterii drojdiei pe glucoza. Aceste reactii au ca rezultat reducerea concomitenta a 2 NAD+. Acetatul este apoi transformat in acetil-CoA, cu ajutorul acetil-CoA sintetazei, ATP dependente, din citoplasma [ [70] , [71] ]. Gruparile acetil activate pot urma in principal doua cai. Ele pot intra in ciclul glioxilatului localizat in citoplasma in cursul caruia doua grupari acetil se unesc pentru a forma succinat [ [72] ]. Succinatul poate intra in matricea mitocondriala pe ruta malat-succinat [ [73] ]. Alternativ, gruparile acetil pot intra in mitocondrie direct pe ruta acetil carnitinei. Pe aceasta cale, gruparile acetil sunt transferate de la CoA la carnitina din citoplasma prin actiunea carnitin-acetil transferazei. Ele intra apoi in matricea mitocondriala unde sunt transferate inapoi la CoA.
Succinatul format in ciclul glioxilatului desfasurat in citoplasma, intra in ciclul TCA din matricea mitocondriala. Excesul de succinat iese din ciclul TCA sub forma de malat care va fi transformat in oxalilacetat, cel ce va intra pe calea gluconeogenezei din citoplasma. O anumita parte a acestui traseu metabolic va fi functionala doar in absenta glicolizei. Astfel, piruvat kinaza [(PK) EC 2.7.1.40] si fosfoenolpiruvat carboxikinaza (PEPCK) EC 4.1.1.49 sunt prezente in celula in acelasi timp, dar catalizeaza reactii opuse: prima este obligatorie pentru gluconeogeneza, iar cea de-a doua pentru glicoliza [[74] ]. Enzimele cheie pentru gluconegeneza si glicoliza sunt bine caracterizate in multe microorganisme, inclusiv in S.cerevisiae [ [75] , [76] , [77] ].
Reactiile specifice catalizate de PEPCK si PK sunt antagoniste metabolic; cand aceste doua enzime si piruvat carboxilaza [(PC) EC 6.4.1.1.] sunt prezente in celula in acelasi timp ele intra intr-un ciclu metabolic (care se repeta) si care duce la irosirea energiei celulare [ [78] ].
In drojdia S.cerevisiae piruvatul este un intermediar cheie in catabolismul zaharurilor, ca si un precursor in sinteza unor aminoacizi cum sunt alanina, leucina, izoleucina si valina [[79] ]. In cazul cresterii pe etanol sau acetat, piruvat kinaza nu participa la catabolismul sursei de carbon, dar prezenta ei este necesara pentru sinteza aminoacizilor mentionati anterior. Sinteza piruvatului se poate face teoretic prin doua mecanisme: (1) din fosfoenolpiruvat sub actiunea piruvat kinazei si (2) prin decarboxilarea malatului sub actiunea enzimelor participante le metabolismul malatului [[80] , [81] ].
Cresterea drojdiilor pe compusi C2 depinde de activitatea enzimelor din ciclul glioxilatului, una dintre cele mai importante fiind izocitratliaza. Activitatea aceastei enzime este extrem de redusa in cazul cresterii pe glucoza, devenind importanta catre sfarsitul fermentatiei atunci cand in mediu se acumuleaza etanol si acetat. Conform datelor prezentate in literatura, factorii ce afecteaza activitatea izoenzimei ADH II influenteaza si activitatea izocitratliazei.
4.1.3. Toleranta la etanol
Drojdia S.cerevisiae fiind o tulpina cu multiple intrebuintari industriale a constituit obiectul unui numar mare de studii privind influenta unor factori de stres asupra vitezei specifice de crestere si a celei de fermentatie a zaharurilor. Desi influenta etanolului a fost intens studiata, concluziile asupra concentratiilor inhibitoare si asupra comportarii culturilor de drojdie sunt foarte diferite. In Figura 3 este prezentata influenta concentratiei etanolului asupra vitezei specifice de crestere a drojdiei S.cerevisiae [[82] [83] [84] [85] , [86] , [87] [88] ]. Asa cum se poate observa influenta etanolului exogen (adaugat in mediul de cultura) difera de cea a etanolului endogen (produs de celule). Una din dificultatile determinarii tolerantei la etanol provine din faptul ca nu exista un mod de definire a acestei notiuni si o tehnica de determinare unanim acceptata [ [89] , [90] , [91] ].
Au fost propuse mai multe mecanisme pentru a explica inhibitia prin etanol [[92] , [93] ]. Acestea includ afectarea proprietatilor de permeabilitate ale membranei celulare, efecte directe asupra enzimelor implicate in metabolismul etanolului, inhibitia prin produs sau acumularea de metaboliti toxici [ [94] , [95] , [96] , [97] ]
Figura 3. Efectul alcoolului etilic asupra vitezei specifice de crestere [137] μ = viteza specifica de crestere ; μ m= viteza specifica maxima de crestere ;
Sursa de etanol : -- adaugat, ------ autogen
a) Continuu [138] ; b) Batch [139] ; c) Continuu [140] ; d) Continuu [141] ; e) Batch [142] ; f) Batch [143] ; g) Continuu; h) Batch [144]
Studii relativ recente [[98] ] s-au ocupat de toleranta la etanol a drojdiilor. Autorul presupune trei efecte majore ale alcoolului in concentratii mari asupra celulelor de drojdie. Etanolul afecteaza cresterea celulei, viabilitatea ei si capacitatea fermentativa. Conform aceleiasi surse bibliografice, etanolul exogen, adaugat unei culturi de S.cerevisiae, este mai putin toxic decat etanolul endogen produs de drojdie [[99] ].
Locurile de atac ale etanolului in celula de drojdie sunt ilustrate in Figura 4.
Figura 4. Tintele posibile ale etanolului in celula de drojdie (D`AMORE (1990).
Unul din efectele etanolului poate fi alterarea organizarii si permeabilitatii membranelor. Jimenezsi Van Uden [[100] , [101]] au propus o metoda bazata pe acidificarea extracelulara pentru testarea rapida a tolerantei la etanol a drojdiilor. Conform autorilor citati, drojdiile etanol - tolerante vor manifesta o valoare de pH extracelular mai scazuta decat drojdiile netolerante. Acest comportament se bazeaza pe faptul ca etanolul provoaca o reintrare pasiva accelerata a protonilor in celula, ceea ce are ca efect general cresterea valorii de pH extracelular. Celulele etanol - tolerante vor fi mai putin afectate de etanol si, de aceea, vor avea o valoare mai scazuta a pH-ului extracelular.
Prell si colab. [145] explica in lucrarea lor legatura dintre fluxurile de ioni provocate de adaugarea etanolului si concentratia oxigenului dizolvat in mediul de cultura in cazul drojdiei Candida utilis.
Scopul studiului lor este elucidarea influentei presiunii partiale a oxigenului in faza gazoasa asupra activitatii catabolice, transportului de ioni prin membrana plasmatica si starii energetice a populatiei de celule.
Candida utilis poate metaboliza etanolul numai in conditii aerobe. Atunci cand este folosit numai aerul, viteza de oxidare a etanolului a fost relativ scazuta. O parte mai mare din etanol este complet oxidat la CO2 si H2O si o fractie mai mica de acetat este eliminata din celula. In concordanta, viteza de acidificare a mediului cauzata de eliminarea ionilor H+ si acizilor din celula este, de asemeni scazuta.
S-au facut observatii pentru celulele aflate la inceputul fazei de lag si pentru celulele in crestere exponentiala. In cazul primelor, dupa doua ore de cultivare cu limitare de etanol, valorile de pH extern si ale concentratiei K+ sunt aproximativ aceleasi indiferent de pO2 in aerul introdus in bioreactor. In cazul cultivarii continue, pentru celulele aflate in faza exponentiala de crestere, efluxul H+ este mult mai puternic, depinzand de rata de dilutie. Schimbul H+K+conduce la formarea unei diferente de pH transmembranare care este treptat
Figura 5. Procesele ce au loc dupa adaugarea etanolului in mediu in cazul drojdiei C.utilis.
mascata de producerea si eliminarea de acetat si lactat, o data cu scaderea presiunii partiale a oxigenului dizolvat in mediu. Prin analogie cu alte specii de drojdie (S.cerevisiae, Kluyveromyces lactis) Prell presupune ca acizii sunt eliminati din celula sub forma de anioni (transport activ), in timp ce intrarea lor in interiorul celulei are loc prin simpla difuzie sub forma moleculelor nedisociate. Procesul este prezentat schematic in Figura 5.
Eliminarea de lactat si acetat este insotita de un influx de potasiu si o scadere a concentratiilor de ATP, ADP si piruvat intracelulare. Corespunzator, o scadere in incarcarea energetica a celulei da nastere unui eflux de K+[[102] ]. Variatiile in nivelul piruvatului intracelular reflecta producerea de intermediari si energie prin metabolizarea etanolului ceea ce afecteaza metabolismul endogen. Acetatul si lactatul sunt rapid eliminate din celule, probabil datorita actiunii rapide a alcoolului, a aldehid-dehidrogenazei si lactat dehidrogenazei. Disparitia lor ulterioara rapida din mediu se poate pune pe seama pornirii procesului metabolic propriu-zis, in care se consuma acesti acizi.
O data cu scaderea concentratiei O2 din mediul de cultura, consumul de acetat si de lactat se diminueaza si nivelul concentratiilor lor din mediu creste din nou. La concentratii scazute de etanol, in conditii de limitare de O2, viteza de consum a acetatului si lactatului extra/intra celular depaseste viteza de producere si eliminare din celule.
Eliminarea lactatului in mediu este o dovada a limitarii prin O2pentru ca lactatul apare din fermentatia substantelor de rezerva cum este glicogenul. Eliminarea acetatului este o consecinta a timpilor morti (cauzati de vitezele de reactie scazute) ce apar in etapele ciclului TCA dupa formarea acetatului, sau in reactiile suntului glioxalic, precum si a reglarii pH intracelular intr-un domeniu optim pentru celule.
Oscilatiile nivelelor de acetat si lactat extracelulare reflecta dinamica vitezei pe fiecare treapta atat in oxidarea etanolului cat si in metabolismul endogen [[103] ].
Diferenta de pH transmembranar depinde direct de nivelul de etanol din mediu. Eliminarea etanolului inseamna disparitia barierei de pH datorita consumului rapid de H+. oglindit de efluxul K+. Nivelul ridicat de etanol nu creste permeabilitatea pasiva a membranei celulare pentru ionii H+. Concentratia inhibitoare de etanol incetineste formarea barierei de pH, modificand fluxurile H+ si K+. Indiferent de concentratia de etanol din mediu, fluxul ionilor de potasiu il depaseste pe cel al ionilor de hidrogen, dar diferenta devine mai mare la concentratii inhibitoare de etanol.
Natura complexa a actiunii etanolului asupra celulei sugereaza implicarea unui mare numar de gene in achizitia tolerantei la etanol.
Etanolul prezent in concentratii mari este fara indoiala un factor de stres pentru celula [[104] ]. Un raspuns imediat al drojdiei este producerea unor compusi cu rol de protectie a componentelor celulare de efectele distructive ale stresului [[105] , [106] , [107] , [108] , [109] ]. Sunt activate imediat caile de producere a semnalelor ce au ca efect ulterior inducerea exprimarii mai multor gene. Produsii controlati de acestea confera protectia celulei [ [110] , [111] ].
Un aspect interesant al raspunsului la stres al celulelor de drojdie este fenomenul dobandirii rezistentei la stres care se produce atunci cand celula este supusa in prealabil unei forme de stres similara sau nu cu cea la care se doreste sa se capete rezistenta dar in conditii mai putin severe [ [112] , [113] , [114] ].
De exemplu, atunci cand celulele sunt expuse la socuri blande de temperatura, ele capata rezistenta la actiunea diferitilor factori de stres, care in mod normal le-ar fi letale [[115] , [116] , [117] ]. Toleranta la stres poate fi indusa fie prin tratamente termice, fie prin tratamente cu substante chimice cum ar fi etanolul [ [118] ]. Expunerea celulelor la actiunea factorilor de stres poate determina inducerea formarii unui grup de proteine cunoscute sub numele de "proteine de soc termic" -hsp (heat shock protein). O mare parte din proteinele de soc termic sunt constitutive fiind prezente in celulele crescute la temperaturi normale. S-a aratat ca in S.cerevisiae inducerea hsp 104 neexprimata la temperatura normala, este necesara pentru a dobandi toleranta la tratamente termice prelungite [[119] , [120] ]. In acelasi timp, preexpunerea la socuri de temperatura conduce la dobandirea de toleranta la etanol [[121] ], dar sistemul nu functioneaza si in sens invers [[122] , [123] ].
Un alt factor potential important in dobandirea termotolerantei este prezenta trehalozei. Termotoleranta drojdiilor este crescuta chiar in absenta proteinei hsp 104 , daca in celula exista acumulari de trehaloza [ [124] , [125] ].
Expunerea la etanol determina sinteza unor proteine hsp [[126] ]. In timpul expunerii la o concentratie de 7% [v/v] etanol, sunt sintetizate 6 proteine, dintre care 4 sunt similare ca marime cu hsp sintetizate atunci cand celulele sunt supuse unui soc termic de la 23 la 37oC [[127] ].
4.1.4. Aspecte tehnologice ale obtinerii biomasei cu drojdii consumatoare de etanol
Cercetarile din ultimile doua decenii asupra obtinerii biomasei cu drojdii s-au orientat in doua directii [[128] ]:
-utilizarea unor substraturi regenerabile (deseuri celulozice) cu pret foarte scazut pentru obtinerea unor produse de uz furajer si
-obtinerea unor produse cu calitati superioare, pornindu-se de la substraturi cu grad ridicat de puritate si compozitie constanta destinate consumului uman (etanol).
In comparatie cu substraturile clasice, etanolul are cateva avantaje demne de subliniat asa cum reiese din Tabelul 1.
De exemplu, etanolul poate fi produs din cereale sau alte surse regenerabile, cu o puritate ridicata. Ca urmare, este acceptat ca materie prima in industria alimentara. Etanolul este usor de depozitat si de transportat, comparativ cu alte substraturi, de exemplu metanul. Nu este toxic ca alcoolul metilic. Este complet solubil in apa (spre deosebire de metan, motorina) ceea ce permite obtinerea unui mediu de cultura omogen, impunand astfel cerinte mai reduse pentru asigurarea transferului de masa in timpul bioprocesului.
Etanolul nu este un inhibitor marcant al activitatii microorganismelor (in special a drojdiilor) ceea ce permite utilizarea unui domeniu mai mare de concentratii in timpul procesului de biosinteza si realizarea unor productivitati ridicate.
Tabelul 1. Avantajele si dezavantajele utilizarii etanolului ca substrat pentru obtinerea biomasei.
Avantaje Dezavantaje
Disponibil ca materie prima foarte pura Cost relativ ridicat
Acceptat ca ingredient alimentar Volatilitate relativ mare in solutii diluate
Usor de manipulat si depozitat Poate fi utilizat de multe specii de microoganisme, prezentand deci un risc ridicat de contaminare
Complet solubil in apa
Nu este un inhibitor marcant pentru majoritatea microorganismelor
Datorita gradului de reducere scazut, necesita mai putin oxigen pentru metabolizare si degaja o cantitate mai mica de caldurain comparatie cu n-parafinele
Poate fi obtinut in cantitati mari, cu o calitate ridicata si din materii prime noi
Fiind un produs partial oxidat, alcoolul etilic necesita pentru metabolizare mai putin oxigen si degaja mai putina caldura. Consumul mai scazut de oxigen este un avantaj tehnologic foarte important tinand seama de faptul ca majoritatea proceselor industriale de biosinteza functioneaza in regim cu limitare de oxigen, acesta fiind unul din impedimentele majore ale operarii proceselor la concentratii celulare ridicate.Un consum de oxigen mai scazut conduce la reducerea cantitatii de caldura degajata pe doua cai :
-se reduce cantitatea de caldura generata in timpul proceselor metabolice si
-se reduce puterea consumata prin agitare care se regaseste in cele din urma tot sub forma de caldura ce trebuie indepartata din proces pentru mentinerea unei temperaturi constante.
Din punct de vedere tehnologic eliminarea caldurii generate este o problema costisitoare deoarece cresterea temperaturii apei de racire este limitata la maxim 8-10o
Aceste avantaje sunt partial contrabalansate de cateva dezavantaje, prezentate de asemenea in Tabelul 1.
Volatilitatea ridicata in solutiile diluate existente in bioreactor duce la pierderi de substrat in aerul exhaustat, scazand astfel randamentul global.
Datorita faptului ca etanolul poate fi utilizat de multe specii de microorganisme, se impun conditii mai severe pentru operarea aseptica a procesului.
Tabelul 2.Randamente in procesele de obtinere a biomasei din etanol.
Sursa bibliografica X [g/l] t[h] S0[g/l] Randament
limitare de etanol
Ziegler (1979) 41, 7 19, 5 60, 5 0, 69
Prokop (1978) 15, 0 9, 0 20, 0 0, 75
Laskin (1977 ) 12, 0 12, 0 16, 0 0, 75
fara limitare de etanol
Watteeuw (1977) 13, 0 35 37, 2 0, 35
Laskin (1977) 7, 0 - 0, 46
MOR (1968) 4, 7 -
0,46
* X = concentratia de biomasa uscata ; So = concentratia de etanol alimentat
Atunci cand microorganismul este crescut in conditii de limitare de etanol, se poate atinge un randament de 0,75 g biomasa/g etanol. Datele din literatura sugereaza ca rezultatele optime se obtin pentru tulpinile din genul Candida la viteze de crestere cuprinse intre 0,25-0,35 [h-1]. Atunci cand se lucreaza la concentratii celulare mari, in domeniul 40-60 [g/l], consumul pentru mentinere creste. Explicatia acestui comportament tine seama de energetic superior mentinerea unor concentratii mari etanol si metaboliti in interiorul celulei, necesare pastrarii activitatii celulare la densitati [135].
In cazurile in care etanolul nu limiteaza cresterea celulara, se obtin randamente variate, dar mai scazute. Valori de 0,35 [g biomasa/g etanol] sunt destul de obisnuite [ [129] ](Tabelul 2).
Date cinetice asupra comportarii unei tulpini de Saccharomyces cerevisiae H1022 in cultivare continua sunt prezentate de Mor si Fiechter [[130] ]-Tabelul 3.
Tabelul 3.Comportamentul drojdiei S.cerevisiae in cultivare continua (Mor si Fiechter, 1968).
D X S Y Qo2 Qco2 RQ
[h-1] [g/l] [g/l]
[ml/g.h] [ml/g.h]
0, 011 4, 08 0, 12 0, 43 9, 9 5, 6 0, 57
0, 029 4, 39 0, 09 0, 461 21, 8 12, 6 0, 57
0, 066 4, 71 0, 06 0, 493 45, 1 23, 3 0, 52
0, 071 4, 70 0, 07 0, 493 45, 3 28, 3 0, 53
0, 102 4, 77 0, 07 0, 500 64, 3 31, 1 0, 49
0, 127 4, 78 0, 22 0, 509 76, 9 38, 3 0, 49
0, 150 4, 69 0, 39 0, 508 87, 9 44, 1 0, 47
0, 166 1, 87 4, 43 0, 362 99, 9 47, 3 0, 47
Obs. X= conc. biomasa ;Y = randamentul de substrat ; Q = consumul specific de oxigen, respectiv degajarea bioxidului de carbon; RQ= coeficientul respirator; S=concentratia substratului.
Dupa cum se poate vedea din acest tabel, la valori mici ale ratei de dilutie randamentul de substrat are valori mici. Pe masura ce rata de dilutie creste, consumul pentru mentinere se pastreaza relativ constant, devenind deci relativ mai putin important, astfel incat randamentul de substrat creste. In conditiile unor dilutii mari se observa din nou o scadere a randamentului de substrat.
Paca si Gregr [[131] ] au studiat dezvoltarea drojdiei Candida utilis pe substrat de etanol intr-un fermentator tip coloana cu agitare la o rata de dilutie de 0,33[h-1]. Concluziile lor pot fi rezumate astfel:
1. Utilizarea fermentatorului tip coloana cu agitare in mai multe trepte permite utilizarea unor concentratii mari de etanol fara pierderi insemnate de etanol in aerul exhaustat;
2. Asigurarea unei recirculari controlate asigura o reinoculare continua cu celule de drojdie adaptate la concentratii crescute de etanol, ceea ce permite folosirea unor dilutii marite;
3. Concentratia maxima de acid acetic este atinsa in cea de-a doua treapta. In etapele urmatoare, acidul acetic este folosit ca sursa de carbon de catre celule, desi exista o concentratie suficienta de etanol;
4. O concentratie mare de etanol in alimentare si un randament acceptabil in biomasa fac posibila atingerea unor concentratii de substanta umeda mari in al patrulea etaj;
5. O rata de dilutie si concentratie de etanol in alimentare mari asigura o productivitate buna;
6. Cresterea concentratiei de etanol in alimentare peste 20 [g/l] nu are nici-un efect asupra continutului in proteina al celulei;
7. Tinand cont de randament, de viteza de transfer a oxigenului, de continutul in proteina al celulei si de productivitatea procesului, valoarea de 50 [g/l] este optima pentru concentratia de etanol in alimentare, la o rata de dilutie de 0, 3 [h-1]. Valorile numerice sunt prezentate in Tabelele 4si 5;
Tabelul 4.Cresterea drojdiei Candida utilis intr-un fermentator multietajat (Paca si Gregr, 1977 ).
Parametrul Etajul 1 Etajul 2 Etajul 3 Etajul 4 So
X [g/l] 5 6 7 8 10
9, 5 9, 8 10 10, 2 20
13 16 20 22 50
17 22 27 30 75
5 6 8 10 80
3 5, 5 8, 5 11 100
Yx/s 60 72 45 0 10
59 37 47 0 20
51 40 48 5 50
53 42 38 15 75
32 17 15 22 80
40 60 55 21 100
Obs: So=concentratia de etanol in alimentare
Tabelul 5.Continutul de proteina (Cp) in functie de concentratia de etanol in influe
So[g/l] 10 20 50 65 75 80
Cp (Etajul 1) 62 37 37 37 36 34
Cp (Etajul 2) 48 30 29 30 29 29
Figura 6 ilustreaza variatiile in randament si productivitate calculate pentru intregul sistem.Valoarea maxima a randamentului (66%) se obtine la So=10 [g/l]. In domeniul de concentratie So=20-75 [g/l], randamentul scade de la 55 la 45%. Depasind concentratia 75 g/l apare o scadere brusca a eficientei utilizare sursei carbon.
Productivitatea fermentatorului creste o data cu concentratia de etanol in alimentare pana la valoarea de 75 [g/l]. Peste aceasta valoare si productivitatea inregistreaza o scadere drastica. Productivitatea maxima -2, 2 [g/l/h]- se obtine la So = 75 [g/l]. Acest maxim se datoreaza realizarii celei mai mari concentratii de biomasa. Dar la aceasta valoare a lui So pierderea de etanol in efluent este prea mare.Tinand cont de acest aspect, concentratia optima de etanol in alimentare este de 50 [g/l], caz in care treapta a 4-a a fermentatorului este alimentata cu 0, 6 [g/l], iar productivitatea globala atinge valoarea de 1,7 [g/l/h].
Figura 6. Influenta concentratiei substratului asupra randamentului si productivitatii.
Intr-o comunicare ulterioara [[132] ], aceiasi cercetatori demonstreaza ca o presiune partiala marita a oxigenului in gazul cu care este alimentat fermentatorul duce la cresterea concentratiei de biomasa, a randamentului si, implicit a productivitatii, comparativ cu conditiile standard. Pentru determinarea regimului optim de aerare s-a studiat concentratia de oxigen dizolvat in fiecare din cele 4 trepte ale fermentatorului.Cum era de asteptat, ultima treapta functioneaza in regim de limitare de oxigen. Aceasta observatie explica scaderea concentratiei biomasei observate anterior. Introducandu-se aer imbogatit in oxigen (Po2=263,5 tori) se observa o crestere a concentratiei de oxigen dizolvat in toate cele patru trepte, cresterea fiind mai mare in cea de-a 4-a treapta comparativ cu primele trei.
Utilizarea aerului imbogatit in oxigen determina cresterea concentratiei celulare in cea de-a 2-a si in cea de-a 4-a treapta si scaderea ei in prima trepta. Aceste rezultate experimentale pot fi explicate daca admitem existenta unui efect inductor al oxigenului la concentratii moderate si a unuia inhibitor in cazul concentratiilor mari.Astfel, in prima treapta este posibila manifestarea unui efect inhibitor combinat datorat concentratiilor mari de etanol si oxigen (in aceste conditii o parte semnificativa din substrat este oxidata la acetat). Prezenta unei concentratii crescute de acetat demonstreaza ca celulele de drojdie au o capacitate scazuta de a utiliza acetatul via TCA si glioxilat, ceea ce duce la o generare modesta de energie in procesul fosforilarii oxidative.
Deoarece utilizarea aerului imbogatit in oxigen mareste substantial pretul de cost al produsului finit, Paca(1980) studiaza posibilitatea utilizarii unei alimentari periodice cu aer imbogatit in oxigen. Procedura optima de aerare propusa de autorul mentionat consta in folosirea unei Po2 = 263,5 tori in aerul alimentat timp de 24 de ore, urmata de o perioada de 50-55 h de aerare normala (Po2=165,9 tori). Acest procedeu economiseste 55-60% din oxigenul pur comparativ cu procedeul de aerare continua cu aer imbogatit in oxigen. In Tabelul 6 se prezinta cativa parametri ai procesului in 3 variante de operare:
I. Utilizarea unui aer imbogatit in oxigen Po2 = 263,5 tori timp de 24 h, dupa care se continua aerarea cu aer obisnuit Po2 = 165, 9 tori
II. Aerare normala Po2 =165, 9 tori
III. Mentinerea unei Po2=208 tori constanta, in aerul alimentat, corespunzatoare aceluiasi consum de oxigen pur ca si in primul caz.
Tabelul 6.Parametrii procesului de obtinere a biomasei pe etanol in sistem continuu in functie de aerare.
X4[g/l] S4[g/l] Yx/s [g/g] Pr[g/l/h]
I 34 0,5 0,69-0,7 2,55-2,6
II 17 15-18 0,51-0,52 1,4
III 25 14 0,61 1,74
Schugerl si colab. [[133] ] compara parametrii procesului de obtinere a biomasei cu Candida boidinii, in functie de sursa de carbon si energie utilizata pentru crestere (Tabelul 7).
Tabelul 7.Compararea valorilor μm, Yx/s, Yo, pentru o tulpina de Candida boidinii, pe diferite substraturi.
Substrat So[g/l] μm[h-1] Yx/ss Yo
Metanol 5 0,104 0,42 0,38
Etanol 5 0,208 0,68 0,66
Glucoza 5 0,327 0,48 1,42
In cazul cresterii fara limitare de substrat se obtine cea mai mare productivitate folosind glucoza si cea mai mica atunci cand substratul este metanolul. Daca cresterea este limitata de transferul de masa al oxigenului, cele mai mari productivitati se inregistreaza tot pentru glucoza datorita randamentului mare fata de oxigen.Cele mai mici productivitati se obtin tot in cazul metanolului din cauza valorilor scazute ale coeficientului de transfer de masa si a randamentului fata de oxigen. Etanolul are o pozitie intermediara in ceea ce priveste productivitatea din cauza valorilor medii pentru μmsi Yo. Randamentul de substrat are insa valoarea cea mai mare pentru etanol [[134] ].
4.1.5. Obtinerea de biomasa liofilizata cu tulpini de Saccharomyces cerevisiae
4.1.5.1. Tulpini de drojdii utilizate
Pentru obtinerea de biomasa proteica viabila s-au utilizat trei tulpini de drojdii din genul Saccharomyces: Saccharomyces cerevisiae 224; Saccharomyces cerevisiae 225; Saccharomyces cerevisiae 226.
4.1.5.2. Medii de cultura
Mediul de cultura pentru inocul si pentru faza de fermentatie contine % (W/V):KH2PO4 0,2, (NH4)2SO4 0,2, extract de porumb 0,2, MgSO4×7H2O 0,05, microelemente 1 ml, pH 4,5, etanol 0,3.
4.1.5.3. Echipamente si sisteme de cultivare
Echipament - Inoculul s-a cultivat in baloane Erlenmeyer de 500 ml cu 100 ml mediu de cultura. Procesul de fermentatie s-a realizat intr-un bioreactor tip LKB, la un volum util de 9l. Parametrii de cultivare au fost: temperatura 280C, agitare 600 - 900 rpm, aerare 0,8 - 1,3 l/l/min. Nivelul oxigenului dizolvat a fost monitorizat de un electrod galvanic (Pb/Ag). Concentratia de CO2 din aerul exhaustat a fost masurat cu ajutorul unui analizator IR tip Infralyt 4 (Junkalor Dessau, Germania).
Fermentatia - Cultivarea celor 3 tulpini de drojdii din genul S. cerevisiae s-a realizat in sistemul de cultivare batch, dupa care biomasa a fost separata din mediul de cultura prin centrifugare si supusa procesului de liofilizare intr-un liofilizator tip L - MIN - D.
4.1.5.4. Metode analitice utilizate
Biomasa uscata (DCW) a fost determinata prin centrifugarea mediului de fermentatie la 5.000 rpm timp de 30', apoi spalarea celulelor cu apa distilata si uscarea acestora pana la greutate constanta la 1050C. Etanolul a fost analizat gaz - cromatografic. Densitatea optica (DO) a fost citita la un spectrofotometru Karl Zeiss Jena, la λ= 570 nm.
4.1.5.5. Parametrii de cultivare si caracteristicile biomasei liofilizate
Evolutia parametrilor de cultivare in sistem batch a celor 3 tulpini de S. cerevisiae precum si rezultatele obtinute sunt prezentate in Tabelul 8 si Figura 6 si 7.
Tabelul 8. Parametrii de cultivare in sistem discontinuu a celor 3 tulpini de S. Cerevisiae.
Duratacultivare (ore) Aer (l/l/m/m) Agitare (rpm) pH Concentratie etanol (%)
0 6 600 4,1 0,25
4 6 600 4,0 0,32
8 9 800 4,0 0,12
12 12 900 4,2 0,26
16 12 900 4,0 0,37
20 14 1000 4,1 0,18
24 15 1000 4,0 0,23
Dezvoltarea biomasei de Saccharomyces cerevisiae s-a realizat prin mentinerea constanta a pH la valoarea 4 si a concentratiei de etanol din mediul de cultura intre 0,1 - 0,35%, ajungandu-se la 24 ore de cultivare la un DCW de 41,25 g/l. Odata cu cresterea concentratiei de biomasa, concentratia O2 dizolvat a scazut si s-a mentinut la pragul de 30%, prin cresterea ratei de aeratie de la 0,8 la 1,3 l/l/m/m, si a agitarii de la 600 rpm la 1000 rpm.
Durata procesului de cultivare a fost de 24 de ore, obtinandu-se 370 g biomasa prin consumarea a 612 g etanol. Consumul specific de etanol a fost de 1,65, iar randamentul de bioconversie in biomasa a fost de 60,5%. Viteza specifica de crestere a celor 3 tulpini de drojdii pe tot parcursul celor 24 ore de cultivare a fost de 0,1 h-1, iar productivitatea celulara a atins 5,77 g×l-1×h-1, cu un TD = 4,95 h.
Biomasa proteica a fost separata din broth prin centrifugare si a fost supusa apoi procesului de liofilizare, dupa ce in prealabil s-a adaugat mediu de protectie (zaharoza 10%), avand dupa procesul de liofilizare o viabilitate de 7,53×10 16 celule/g biomasa. Caracteristicile fizico - chimice ale biomasei liofilizate sunt prezentate in Tabelul 9.
Tabelul 9. Caracterizarea analitica a biomasei liofilizate de S. cerevisiae 224, 225, 226.
Nr. crt. Parametrii Valori
1 Aspect Biomasa liofilizat, amorfa
2 Culoare Alb - bej
3 Miros Caracteristic
4 Pierdere prin uscare (%) 4,67
5 Rezidiu sulfatat (%) 4,97
6 Metale grele (%) Absent
7 Azot total (%) 6,913
8 Azot amoniacal (%) 0,313
9 Proteina totala (% s.u.) 43,27
10 Acizi nucleici (%) 2,8
11 Lipide (%) 6,1
Biomasa obtinuta in urma procesului de liofilizare si caracterizata fizico - chimic si din punct de vedere al viabilitatii celulelor de drojdii a fost apoi formulata ca produs probiotic sub forma de capsule gelatinoase.
[1] . TANG Jenny., BRACKENRIDGE I., ANDREW J.; Tetrahedron 51: 13217-13238 (1995).
[2] . GOCHO S., TABOGAMI N.; KOMAI T.; Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:1571-1572 (1995).
[3] . FUGANTI C., SARRA Antonella, SERVI S.; Tetrahedron :Asym. 5: 1135-1138 (1994).
[4] . KOUL S., KROUT D.H.G., TAX J.; J.Chem. Soc. Perkin.Trans. 1, 23: 2969-2988 (1995).
[5] . CHARTRAIN M., KATZ L., KING A.; Bv. SUA 5 474 919 (1995).
[6] . PATEL R., LIU M., SZARKA L.M.; Bv. SUA 5 393 663 (1995).
[7] . BERGOGNE-BEREZIN E.; La Presse Medicale 24:145-156 (1995).
[8] . DOBIAS J., EBRINGER L.; Bv. SK 172897 (1999).
[9] . DZJAVGO L.A., MASLOV D.V., PANKRATOVA Tatiana M.; Bv. RU 2119796 (1998).
[10] . FULLER R.; J.Appl. Bacteriol. 66: 365-378 (1989).
[11] . Kung L. J.r., Kreck E.M., Tung R.S., Hession A.O., Sheperd A.C., Cohen M.A., Swain H.E., Leedle J.A.; J Dairy Sci 80:2045-2051 (1997).
[12] . JONG-GUBBELS, Patricia, VAN DIJKEN J., PRONK J.; Microbiology 142:1399-1407 (1996).
[13] . LARSSON C., PAHLMAN INGA., GUSTAFSSON LENA.; Yeast 14:347-359 (1998).
[14] . KEULERS M., SUZUKI T., KURIYAMA H.; Yeast 12: 673-682 (1996).
[15] . KEULERS M., SUZUKI T., KURIYAMA H.; FEMS Microbiol. Lett. 142:253-258 (1996).
[16] . RAHMAN D.R.J., SUDBERY P.E., MARISON I.W.; J. Gen. Microbiol. 134:2241-2248 (1988).
[17] . BAKER W.; Biochem. Ed. 23:216-217 (1995).
[18] . SATROUTDINOV A.D., KURIYAMA H., KOBAYASHI H.; FEMS Microbiol Lett. 77:261-267 (1992).
[19] . PRELL A., PACA J., SIEGLER K.; Folia Microbiol. 37:39-42 (1992).
[20] . PACA J., VOTRUBA J.; Folia Microbiol. 36: 478-484 (1991).
[21] . PACA J., VOTRUBA J.; Folia Microbiol. 36: 485-492 (1991).
[22] . PACA J., VOTRUBA J.; Folia Microbiol. 39: 65-70 (1994).
[23] . VOTRUBA J., PACA J.; Folia Microbiol. 37: 133-139 (1992).
[24] . PRELL A., PACA J., SIEGLER K.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 36:236-239 (1991).
[25] . MINKEVICH I.G., BAUMANN F., HEINRITZ B., Acta Biotechnol 8: 435-444 (1988).
[26] . PRELL A., SAFAR H., SOBOTKA M.; Lecture 4 -Lucrarile Conferintei CHISA 1997, Srni, Rep. Ceha (1997).
[27] . LASKIN A.; Biotechnol. Bioeng. 7: 81-103 (1977).
[28] . HITZMAN D.O.; Ultra high cell density fermentation, presented in connection with People to People Citizen Ambassador Program (1984).
[29] . WILLS C; Critical Rev. in Biochem. Mol. Biol. 225: 245-280 (1990).
[30] . Shachar - Nishri Y., Freeman A.; Appl. Biochem. Biotechnol. 39/40: 387-399 (1993).
[31] . HEINISCH J.J., VALDEZ E., ALVAREZ J.; Yeast 12:1285-1295 (1996).
[32] . FERNANDEZ E., MORENO F., RODICIO R.; Eur.J.Biochem. 204:983-990 (1992).
[33] . Humphrey A.E. (1980); "Production of Single Cell Protein from Ethanol"; Presented at Symposyum held in London, Ed.Pergamon Press Toronto
[34] . CHENG L., LEK L.; FEBS Lett 300: 251-253 (1992).
[35] . MAGONET E.; HAYEN P., REMACLE J.; Biochem. J. 287: 361-365 (1992).
[36] . GUOQIANG D., KAUL. R, MATTIASSON. B.; Biotechnol. Prog 11: 187-193 (1995).
[37] . CHO J-Y, JEFFRIES T.; Appl. Environ. Microbiol. 64: 1350-1358 (1998).
[38] . BENITEZ T., MARTINEZ P., CODON A. C.; Microbiologia 12: 371-384 (1996).
[39] . HEICK H. N. C.; Can. J. Microbiol 18: 23-28 (1972).
[40] . VALLARI R. O., COOK W. J., MORGAN N. J.; Mol. Cell. Biol 12: 1663-1673 (1992).
[41] . GOULD R.M., PLAPP V.B.; Biochemistry 29: 5463-5468 (1990).
[42] HOFFMANN K.H., POLNISH E.; J. Basic Microbiol. 30 333-336 (1990).
[43] PALMIERI L., WALKER I.E.; FEBS Lett 417: 114-118 (1997).
[44] TRIVIC S, LESKOVAC V.; Biochem. Mol. Biol. Inter 32: 399-407 (1994).
[45] REID M.F., FEWSON C.A.; Crit. Rev. Microbiol. 20: 13-56 (1994).
[46] PETKOVA Elena .B.; Folia Microbiol 43: 210-211 (1998).
[47] MACIVER F.H., DAWE I.W. GRANT C.M.; Curr. Genet. 31: 119-121 (1997).
[48] SCHJERLING C.K., HUMMEL R., HANSEN J.K.; J.Biol. Chem. 271:22514-22521 (1996).
[49] CIRIACY M.; Mutat Res. 29: 315-326 (1975).
[50] GRIMM C., SHAER P., NUNZ P., KOHLI J.; Mol. Cell. Biol. 11: 289-298 (1991).
[51] CHAO J.Y., JEFFRIES T. W.; Appl. Environ. Microbiol. 64:1350-1358 (1998).
[52] RUSSEL D.W., SMITH M.; J.Biol.Chem 258: 2674-2682 (1983).
[53] JONG- GUBBELS Patricia., VAN DIJKEN J.P.; Yeast 11 407-418 (1995).
[54] LUTSDORF U., MEGNET R.; Arch. Biochem.Biophys. 126:933-944 (1968).
[55] WILLIAMSON V.M., COX D. , YOUNG E.T., SMITH M.; Mol. Cell .Biol. 3: 20-31 (1983).
[56] YOUNG E.T., PILGRIM D.; Mol. Cell .Biol. 5: 3024-3034 (1985).
[57] YANG V.W.; MARK J.A. DAVID, B.P., JEFFRIES T.W.; Appl. Environ.Microbiol. 60:4245-4254 (1994).
[58] SHAIN D.H., DENIS C.L.; Mol.Gen. Genet. 232:479-488 (1992).
[59] MAZZONI C., SALIOLA M., FALCONE C.; Mol. Microbiol. 6:2279-2286 (1992).
[60] MEADEN P.G., DIKINSON F.M., BUSHEL H., Yeast 13: 1319-1327 (1997).
[61] BUSHELL H., KABACK D.B., ZHOUG W; Proc. Natl. Acad.Sci. USA 92: 3809-3813 (1995).
[62] Wang X., Mann C.J., Bai Y., Ni L., Weiner H.; J Bacteriol. 180:822-30 (1998).
[63] DICKINSON F.M., HAYWOOD G.W.; Biochem J. 247: 377-384 (1987).
[64] DICKINSON F.M.; Biochem J. 315: 393-399 (1996).
[65] Tessier W.D., Meaden P.G., Dickinson F.M., Midgley M.; FEMS Microbiol. Lett. 164:29-34 (1998).
[66] SAIGAL D., CUNNINGHAM S.J., FARRES J., WEINER H.; J. Bacteriol. 173:3199-3208 (1991).
[67] FELDMANN H., AIGLE M., AJINOVICI G.; EMBO J. 13: 5795-5809 (1994).
[68] . GIETZ R.D., WILLEMS A.R., WOODS R.A.; Yeast 11: 355-360 (1995).
[69] FLIKWEERT M.T., VAN DER ZANDEN L., PRONK J.T.; Yeast 12: 247-257 (1996).
[70] SHU C.H., YANG S.T.; Appl. Environ. Microbiol. 62: 3152-3157 (1996).
[71] DE VIRGILIO C., BURCKERT M., BARTH G., NEUHAUS J.M; Yesat 8:1043-1051 (1992).
[72] MONTEIRO G.A., Sa-Correia I.; Biochim. Biophys Acta 1370: 310-316 (1998)-cf. Medline PMID 9 545 589.
[73] HAARASILTA S., TASKINEN L., Arch. Microbiol. 113: 159-165 (1977).
[74] WILSON A., BHATTACHARJEE J.K.; Can. J. Microbiol. 32: 969-972 (1986).
[75] LARRSON C., PAHLMAN I.L., ANSELL R., GUSTAFSSON L.; Yeast 14: 347-357 (1998).
[76] JIMENEZ J., OBALLE J.; Mol. Gen. Genet. 245:86-95 (1994).
[77] FITTON V., RIGOULET M., OUHABI R., GUERIN B. Biochemistry 33:9672-9698 (1994).
[78] BOLES E., JONG-GUBBELS Patricia, PRONK J.T.; J.Bacteriol. 180:2875-2882 (1998).
[79] PRONK J.T., STEENSMA H.Y., VAN DIJKEN J.P.; Yeast 12:1607-1633 (1996).
[80] VILJOEN M., SUBDEN R.E., KRIZUS A.VIUREN H.J.J.; Yeast 10:613-624 (1994).
[81] FERNANDEZ M.J. MADRANA M., RUZ AMIL M, LASADA M.; Eur.J.Biochem. 3:11-18 (1967).
[82] Hoppe G. K., Hansford G. S.; Biotechnol. Lett. 4 39 - 44 (1982).
[83] Bazua C. D., Wilke C. R., Biotechnol. Bioeng. Symp. 7:105 - 118 (1977).
[84] HolzbergI., Finn R. K., Steinkraus K. H.; Biotechnol. Bioeng. 9: 413 - 427 (1967).
[85] Ghose T. K., Tagi R. D.; Biotechnol. Bioeng. 21: 1401 - 1420 (1979).
[86] Egamberdiev N. B., Ierusalimskii N. D.; Microbiologiya 37: 687-694 (1968).
[87] Aiba S., Shoda M., J. Ferment. Technol. 47: 790 - 794 (1969).
[88] Strehaiano P., MorenoM., Goma G.; C. R. Acad. Sci. Ser. D. 286: 225-242 (1978).
[89] CARLSEN E., DEGN H., LLOYD D.; J. Gen.Microbiol. 137: 2879-2883 (1991).
[90] IGLESIAS R., FERREAS J.M., LLOYD D.; Biotechnol. Bioeng. 37:389-391 (1991).
[91] ROSA M.F., SA-CORREIA I.; FEMS Microbiol Lett. 135: 271-274 (1996).
[92] Oliveira S.C., Paiva T.C., Visconti A.E., Giudici R.; Appl Biochem Biotechnol 74:61-72 (1998).
[93] Ciesarova Z, Smogrovicova D, Domeny Z.; Folia Microbiol. 41:485-488 (1996).
[94] KOUKON A.I., TSAUKATOS D., DRAINAS C.; J.Gen. Microbiol. 136: 1271-1277 (1991).
[95] JONES R.P.; Enz. Microb. Technol 9:334-338 (1987); Jones R.P., Greenfield P.F.: Yeast 3:223-232 (1987).
[96] JONES R.P., GREENFIELD P.F.; Enz. Microb. Technol 11:130-153 (1989).
[97] Ciesarova Z, Domeny Z, Smogrovicova D, Patkova J, Sturdik E.; Folia Microbiol 43:55-58 (1998).
[98] D' Amore T., Panchal C., Russell I., Stewart G.G.; Crit. Rev. Biotechnol. 9:287-304 (1990).
[99] Dassari G. ,Worth M.A., Connors N.A, Pamment N.B.; Biotechnol. Bioeng., 35:109-122 (1990).
[100] Jimenez J., van Uden N.; Biotechnol. & Bioeng. 25:1596-1605 (1985).
[101] Jimenez J., Benitez H.; Trends Biotechnol. 4 :40-46 (1987).
[102] Sigler K., Knotkova A., Kotyk A.; Biochim. Biophys. Acta 643: 572-582 (1981).
[103] Lenbury Y, Neamvong A, Amornsamankul S, Puttapiban P.; Biosystems 49:191-203 (1999).
[104] HOFFMANN S., MAGER W.H.; ``Yeast Stress responses`` (1997) Springer Verlag, Heidelberg, Germany.
[105] SINGH K.K., NORTON R.S.; Arch. Microbiol. 150:38-42 (1991).
[106] MAGER W.H., VARELO J.C.S.; Mol. Microbiol 10:253-258 (1993).
[107] CHOWDHURY S., SMITH K.W., GUSTIN N.C.; J.Cell Biol 118: 561-571 (1992).
[108] Alexandre H., Plourde L., Charpentier C., Francois J.; Microbiology 144:1103-1111 (1998).
[109] Hounsa C.G., Brandt E.V., Thevelein J., Hohmann S, Prior B.A.; Microbiology 144 :671-680 (1998).
[110] MAGER W.H., DE KRUIJFF A.J.J.; Microb.Rev 59: 506-531 (1995).; Biochem.J. 290:1-13 (1993).
[111] MAGER W.H., MORADAS FERREIRA P.N.; Biochem.J. 290:1-13 (1993).
[112] DAVIES J.M., LOERY C.V., DAVIES K.J.A.; Arch. Biochem Biophys. 317:1-6 (1995).
[113] COOTE P.J. COLE N.B., JONES M.V.; J.Gen. Microbiol. 137: 1701-1708 (1992).
[114] Parascandola P, de Alteriis E, Sentandreu R, Zueco J.; FEMS Microbiol Lett 150:121-126 (1997).
[115] TAMURA K., MIYASHITA M.., IWAHASHI H.; Biotechnol.. Lett. 20:1167-1169 (1998).
[116] COUTO J.A., PINA C., HOGG T.; Biotechnol. Lett. 19:487-490 (1997).
[117] KOMATSU K.., KAUL S.C., OBUCHI K.; FEMS Microbiol. Lett. 72:159-162 (1990).
[118] TANJI K., NATAORI S., SEKIMIZU K.; Biochim. Biophys. Acta 1129: 172-176 (1992).
[119] HOTTIGER T., DE VIRGILIO C., HALL N.N., BOLLER T.; FEBS Lett. 219:187-193 (1994).
[120] IWAHASHI H., KAUL S.C., KOMATSU K.; FEMS Microbiol Lett. 80: 325-328 (1991).
[121] . SANCHEZ Y., TAULIEN J.; EMBO J. 11: 2357-2364 (1992).
[122] PIPER P.W. FEMS Microbiol Lett. 134: 121-127 (1995).
[123] PIPER P.W.; FEMS Microbiol Rev. 11: 339-356 (1993).
[124] DE VIRGILIO C., HOTTIGER T., WIEMKEN A.; FEBS Lett. 219:179-186 (1994).
[125] VAN DIJK P., THEVELEIN J.M.; Appl. Env. Microbiol. 61: 109-115 (1995).
[126] GOLD R.S., HUTKINS R., CONWAY T..; J.Ind. Microbiol 10:45-54 (1992).
[127] VOLKER U., MACH H., HECKER M.; J. Gen. Microbiol. 38:2125-2135 (1992).
[128] Anghel I., Herlea Victoria, Vassu Tatiana, Segal B., Berzescu P., Oancea Ioana (1991) "Biologia si Tehnologia Drojdiilor " Ed. Tehnica Bucuresti.
[129] PEJIN D.; RAZMOV S.K.I. R.; J.Appl. Bacteriol. 80:53-55 (1996).
[130]Mor J., Fiechter A.; Biotechnol. Bioeng.10:159-176 (1968).
[131] Paca,J., Gregr,V.; Biotechnol. Bioeng. 19:539-554 (1977).
[132] PACA, J.; Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 9:93-100 (1980).
[133] Schugerl K.; Adv. Biochem. Bioeng. 8 p.106 (1978).
[134] Shkidchenko A. N.; Mikrobiologiia 53:58-62 (1984).
[135] JIMENEZ J., BENITEZ H.; Trends Biotechnol. 4 :40-46 (1987).
[136] RUSSEL D.W., SMITH M.; J.Biol.Chem 258: 2674-2682 (1983).
[137] HOPPE G. K., HANSFORD G. S.; Biotechnol. Lett. 4 39 - 44 (1982).
[138] BAZUA C. D., WILKE C. R., Biotechnol. Bioeng. Symp. 7:105 - 118 (1977).
[139] HOLZBERG I., FINN R. K., STEINKRAUS K. H.; Biotechnol. Bioeng. 9: 413 - 427 (1967).
[140] GHOSE T. K., TYAGI R. D.; Biotechnol. Bioeng. 21: 1401 - 1420 (1979).
[141] EGAMBERDIEV N. B., IERUSALIMSKII N. D.; Microbiologiya 37: 687-694 (1968).
[142] AIBA S., SHODA M., J. Ferment. Technol. 47: 790 - 794 (1969).
[143] AIBA S., SHODA M., J. Ferment. Technol. 47: 790 - 794 (1969).
[144] STREHAIANO P., MORENO M., GOMA G.; C. R. Acad. Sci. Ser. D. 286: 225-242 (1978).
[145] PRELL A., PACA J., SIEGLER K.; Folia Microbiol. 37:39-42 (1992).
