După efectuarea reacţiei R-Mastitest şi aplicarea Mast-O-Testului (care măsoară conductibilitatea electrică a laptelui), din sferturile mamare considerate pozitive s-au recoltat probe de lapte pentru examenul de laborator, în condiţii cât mai sterile.
În vederea stabilirii diagnosticului de mamită, realizarea examenului bacteriologic pentru probele de lapte recoltate de la vacile suspecte are ca scop identificarea agentului etiologic.
Examenul bacteriologic cuprinde:
- examenul bacterioscopic;
- izolarea şi tipizarea agentului etiologic;
- cercetarea patogenităţii agentului etiologic izolat
Probele de lapte recoltate au fost însămânţate pe medii uzuale (bulion, agar) şi pe mediu de îmbogăţire cu sânge. După incubare (370C, 24 ore) s-au efectuat examenele bacterioscopice şi bacteriologice. Au fost studiate numai culturile în care s-au constatat monoculturi sau cel mult două tipuri de colonii dintre care una predominantă iar mediile care au prezentat colonii mixte au fost ignorate întrucât este aproape imposibil de precizat care dintre germeni au rolul determinant şi care sunt oportunişti.
Au fost identificaţi ca agenţi patogeni următoarele specii bacteriene: Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. şi Klebsiella pneumonie.
Pentru izolarea agenţilor etiologici, probele de lapte recoltate au fost refrigerate până în momentul efectuării examenelor bacteriologice şi bacterioscopice (intervalul de timp nu trebuie să depăşească 24 ore). Se poate recurge şi la îngheţarea probelor de lapte, dacă intervalul de timp până la examinare depăşeşte 48 ore. Probele de lapte îngheţate se vor menţine în această stare până când vor fi livrate laboratoarelor specializate şi ulterior dezgheţate. Îngheţarea şi dezgheţarea repetată determină reducerea posibilităţilor de izolare din lapte a agenţilor etiologici microbieni, în special a micoplasmelor. Probele de lapte pot fi păstrate îngheţate pe durata unui interval de timp acceptabil, de câteva săptămâni.
Păstrarea probelor de lapte la temperatura de refrigerare, mai mult de 48 ore, va permite multiplicarea şi creşterea numerică a altor microorganisme psihrofile decât cele care constituie agentul etiologic cauzal.
Probele de lapte au fost prelucrate la Disciplina de Boli Infecţioase din cadrul Facultăţii de Medicină Veterinară Timişoara.
Fişele individuale ale vacilor examinate au fost centralizate într-un alt tip de tabel.
Nr. matricol Vârsta Nr. probă Aspectul laptelui Aspectul glandei mamare Citire Mast-O-Test R-Mastitest pH -ul laptelui Diagnostic bacteriologic Diagnostic citologic Tratament Categia mamitelor
Categoria în care se încadrează mamitele au la bază următoarele criterii:
- pentru categoria I sau criterii de normalitate: aspectul laptelui normal, valoarea Mast-O-Test cuprinsă între 54 - 70 şi examen bacteriologic negativ (lapte steril);
- pentru categoria II sau criterii de mamită subclinică: aspectul laptelui normal, conductibilitatea electrică a laptelui prezintă valori de peste 70 şi examen bacteriologic pozitiv sau negativ;
- pentru categoria III sau criterii de mamită clinică: aspect normal al glandei mamare dar laptele este modificat organoleptic (mamitic), conductibilitate electrică crescută, examen bacteriologic pozitiv;
- pentru categoria IV sau criterii de mamită acută: inflamaţia glandei mamare, lapte mamitic şi examen bacteriologic intens pozitiv.
De asemenea, probele recoltate au fost, la rândul lor, împărţite în trei categorii, astfel:
- lapte mamitic: aspect normal dar pozitiv la teste;
- secreţie mamară patologică: lapte modificat organoleptic, cu sediment;
- secreţie mamară patologică purulentă.
Efectuarea lactocitogramelor.
Lactocitogramele s-au efectuat din frotiuri din lapte integral şi din lactosediment (obţinut prin centrifugare). Pentru secreţiile mamare patologice şi cele purulentă centrifugarea nu se mai justifică, pe motiv că celularitatea în aceste situaţii este extrem de bogată.
Degresarea lamelor de sticlă este o etapă extrem de importantă, deoarece influenţează calitatea preparatelor histologice. Pe lamele nedegresate, etalarea laptelui este neuniformă, din punct de vedere al grosimii şi distribuţiei celulelor (interpretarea lactocitogramei va fi eronată), iar calitatea colorării este slabă. Cea mai bună degresare a lamelor se realizează prin spălarea acestora în acizi (HCl / H2SO4 1N).
Picătura de lapte recoltată, care nu trebuie să fie prea mare pentru a nu obţine un frotiu gros, dificil de examinat, se pune la una din marginile lamei. Această picătură se etalează, cu ajutorul unei lame "de întins" , înclinată sub un unghi de 450, printr-o mişcare de translaţie rapidă până la celălalt capăt al lamei.
Uscarea frotiului se recomandă a se realiza prin agitare, deoarece prin uscare lentă, care se produce zonal, se alterează integritatea unor celule.
Un frotiu de lapte realizat corect prezintă un aspect lucios, care prin uscare, devine mat.
De asemenea, după Ognean şi colab., examenul citologic se mai poate realiza prin etalarea laptelui între două lamele de sticlă (cele mai utilizate sunt lamelele de 2,5 / 2,5 cm). În mijlocul unei lamele se pune o picătură de lapte sau de lactosediment (diametrul picăturii nu trebuie să depăşească 2 - 3 mm), peste care se aplică o altă lamelă, astfel încât cele două lamele să formeze un octogon. După difuzarea omogenă a laptelui, prin capilaritate, se trece la desprinderea celor două lamele, prin tracţiune orizontală rapidă. De regulă, pe una din cele două lamele se obţine un frotiu de calitate bună.
Grăsimea din lapte constituie cel mai semnificativ impediment, care poate compromite în totalitate preparatele sau să conducă la obţinerea unor frotiuri greu de interpretat, datorită calităţii lor mediocre.
În acest sens, iniţial, frotiurile uscate au fost introduse în benzen, 15 minute, spălate în alcool 700 şi în apă distilată, urmând apoi colorarea prin metoda dorită. Totuşi, datorită încărcării excesive cu grăsime a frotiurilor realizate din laptele normal, prin tatonare, am utilizat alcoolul 960 ca fixator, xilenul, 10 minute, apoi spălările în alcool 600 şi în apă distilată, cu rezultate bune. Pentru frotiurile realizate din lapte mamitic sau din secreţii mamare patologice, degresarea s-a realizat timp de 5 - 8 minute sau deloc, deoarece încărcătura cu micelii de grăsime şi cazeină este mult redusă.
Pentru probele care prezintă puţine celule sau pentru o mai bună aderenţă a filmului de lapte pe frotiuri am utilizat în prealabil albumina Mayer sau poli-L-lizina. În acest caz, frotiurile au fost prelucrate histologic a doua zi, fiind necesară uscarea acestora peste noapte. De asemenea, pentru o mai bună conservare a frotiurilor (deoarece laptele este o materie organică) am aplicat, după uscarea acestora, o soluţie de polietilenglicol.
Totuşi, pentru obţinerea unor frotiuri calitative, probele de lapte au fost prelucrate în maxim 6 ore de la recoltare.
Dacă probele de lapte au sosit la laborator mai târziu faţă de momentul recoltării, acestea au fost încălzite în termostat, timp de 20 - 30 minute, la 380C. Înainte de răcirea acestora la o temperatură de 200C, din fiecare probă s-a recoltat o cantitate mică de lapte, de aproximativ 0,01 ml, şi care, sub formă de picătură pusă la una din marginile lamei, a fost etalată prin acelaşi procedeu ca şi în hematologie.
Frotiurile de lapte au fost colorate utilizând metode specifice din hematologie şi citologie, dintre care reprezentative au fost:
- May Grünwald Giemsa (panoptică Pappenheim)
- Verde metil pironină (Lison)
- Dănilă Muster
- Papanicolau
- APT Drăgan
- Harris - Shorr
- Leishmann
- Romanovski
- Leishmann - Romanovski.
Lactocitograma, în comparaţie cu leucograma, reprezintă un examen calitativ şi cantitativ al leucocitelor şi al celulelor epiteliale (prin care se stabileşte procentul fiecărui tip de leucocite şi de celule epiteliale, din numărul total de celule numărate).
Pentru stabilirea formulei leucocitare este necesară alcătuirea unui tabel care să cuprindă varietăţile de leucocite şi numărul lor, stabilit pe parcursul examinării frotiului.
Formula leucocitară pentru lapte se calculează astfel:
Numărul de leucocite dintr-o clasă x 400
Total leucocite numărate
Rezultate şi discuţii
La examenul bacterioscopic şi bacteriologic al probelor de lapte însămânţate s-au observat următoarele:
- pentru Staphylococcus spp. - în mediile lichide, produce o turbiditate intensă cu depozit necaracteristic, iar pe mediile solide formează colonii rotunde, cremoase, netede, lucioase, pigmentate. Pigmentul carotenoid portocaliu sau galben - citrin este o caracteristică relativ constantă a tulpinilor de Staphylococcus aureus, cultivate în aerobioză. La examenul bacteriologic: stafilococii sunt bacterii de formă sferică, mici, care se divid în planuri perpendiculare succesive, grupându-se într-un aspect caracteristic de ciorchine; sunt Gram pozitive, nesporulate, neciliate şi necapsulate.
- pentru Streptococcus spp. - pe medii solide, streptococii formează colonii mici, semitransparente, cu margini regulate, cu aspect mucoid (de picătură care se prelinge) şi nepigmentate, iar pe mediile lichide (bulion cu ser) produc turbiditate, flocoane sau granule. La examenul bacteriologic: streptococii au formă rotundă sau ovală, grupaţi în lanţuri de lungime variabilă. Sunt bacterii Gram pozitive, neciliate şi nesporulate.
LEUCOCITELE POLIMORFONUCLEARE
Din punct de vedere al morfologiei celulare şi indiferent de metoda de colorare, în urma examinării la microscopul optic a polimorfonuclearelor neutrofile (PMN) din lapte s-a constatat că acestea sunt similare neutrofilelor din sânge, dar sunt mai reduse în dimensiune. Această simililaritate se explică prin faptul că leucocitele neutrofilele sunt întotdeauna celule de filtraţie.
Nucleul prezintă particularităţi, fiind segmentat sau polilobat iar citoplasma, în funcţie de cele trei tipuri în care se clasifică (neutrofile, eozinofole, bazofile - existente şi în sânge), conţine granulaţii cu afinităţi tinctoriale diferite.
Polimorfonuclearele neutrofile prezintă un nucleu polilobat, căruia gradul de segmentaţie are aceeaşi semnificaţie morfologică la fel ca şi în cazul aceluiaşi tip de celule din sânge. Citoplasma prezintă granulaţii foarte fine şi dispersate. Forma polilobată a nucleului neutrofilelor este foarte importantă, deoarece permite o aliniere rectilinie a lobilor şi migrarea rapidă a acestor celule printre celulele endoteliale sau epiteliale alveolare din glanda mamară (Fig. 1).
Dimensiunea neutrofilelor în lapte variază de la 10 - 14 µm, până la 5 - 10 µ. Acest fapt pledează pentru faptul că nu toate neutrofilele provin din sânge, ci ajung în lapte şi cele din ţesutul conjunctiv al glandei mamare, care sunt mai mici. Dar, totodată, dimensiunea mică a neutrofilelor poate fi explicată şi prin faptul că acestea îşi pierd pseudopodele în timpul fagocitozei globulelor de grăsime şi a cazeinei, prin internalizarea membranei celulare, în scopul formării fagozomilor, care conţin aceste componente ale laptelui. Prin urmare, în neutrofilele din lapte, fenomenul de endocitoză predomină exocitoza şi, din acest motiv, pentru funcţionarea fagocitozei la capacitatea maximă, celulele ar necesita o suprafaţă celulară foarte mare, care să permită formarea simultană a pseudopodelor, a fagozomilor, care să conţină componentele laptelui şi endocitoza bacteriilor.
În frotiurile efectuate din lapte nemamitic, neutrofilele se dispun izolat, în comparaţie cu cele din laptele cu infecţii mamare, în care se constată aglomerarea lor (în frotiu se constată un aspect "tumoral"). În aceste "aglomerări" se înglobează limfocite, macrofage şi detritusuri, fenomen care se accentuază pe măsură ce procesul infecţios avansează (Fig. 2).
De asemenea, pe măsură ce procesul infecţios şi inflamator avansează sau mamita trece în formă cronică procentul de neutrofile moarte prin apoptoză sau epuizate fiziologic este foarte mare.
Fig. 2. Modul de dispunere a neutrofilelor din laptele mamitic: A - în neutrofile se observă prezenţa agentului patogen (Streptococcus spp. →), coloraţie APT Drăgan, B - Aspect "tumoral" în mamită purulentă, coloraţie Leishmann - Romanovski (original)
Granulaţiile eozinofilelor din lapte, similar celor din sânge, încarcă în totalitate celulele şi se evidenţiază cel mai bine prin metodele May Grünwald Giemsa, Leishmann - Romanovski şi Dănilă Muster (Fig. 3). Granulaţiile sunt numeroase, mici, uniforme şi sferice, care se colorează intens în oranj şi care încarcă în totalitate celula iar nucleul poate fi bilobat sau numai scobit. De asemenea, şi eozinofilele sunt mult reduse în dimensiune în comparaţie cu eozinofilele sangvine, întâlnindu-se în procent foarte mic.
Bazofilele sunt celule de formă sferică, cu diametrul de 10-12 micrometri şi nucleul incomplet segmentat. Granulaţiile din citoplasmă au forme şi dimensiuni variate, colorate în albastru - violet. Tinctorialitatea granulaţiilor este instabilă, putându-se decolora rapid şi total. Până în prezent, în literatura de specialitate şi în cadrul studiilor noastre nu s-a semnalat prezenţa acestora în lapte.
