Biodispozitive pentru prelevare individuala a celulelor vii

Biodispozitive pentru prelevare individuala a celulelor vii

Principiile de functionare ale acestor biodispozitive sunt bazate pe legi fizice, chimice si biologice in general. Dar fabricatia lor este posibila doar prin utilizarea micro si nanotehnologiilor. Acesta a fost motivul esential, pentru care dezvoltarea acestor biodispozitive a putut fi pusa in practica mai mult de catre ingineri microelectronisti decat de catre biologi.

1. Biodispozitive pentru incapsulare individua la a celulelor vii

In acest domeniu s-a cautat un material suport, biocompatibil cu celulele vii, prelucrabil prin metode MEMS/NEMS, pentru a furniza locasuri individuale pentru celule. O celula izolata in aceasta capsula poate fi alimentata cu nutrienti, iar in final i se pot masura unii parametri biologici precum: ratele de asimilatie/dezasimilatie, timpul de viata, proliferarea.

Unul dintre mediile de implantare unicelulara a fost siliciul nanoporos cu pori de dimensiuni cuprinse intre 7 si 49nm, [81, 82]. Celulele depuse pe

acest substrat au fost celulele secretoare de insulina (insulinome). In paralel s-a studiat comportamentul acestor celule pe suporturi binecunoscute in biologie: (a) suport din latex si (b) suport dintr-un material de referinta ("petri dishes"). Dupa 8 zile, procentajul de supravietiure al celulelor insulinome a fost cuprins intre 90-100% pe materialul de referinta, dar si pe membrana de siliciu poros, iar pe membrana de latex de doar 70%. Dupa 4 zile proliferarea celulelor insulinome a fost de acelasi ordin de marime, 5×10⁵celule/ml, pe membranele de Si-poros si de "petri dishes" si mult mai mica pe suportul de latex, 2×10⁴celule/ml. Dupa inca 4 zile (deci 8 zile in total), proliferarea pe suportul de referinta a ajuns la 4,5×10⁶celule/ml, pe Si-poros a ajuns la 2×10⁶celule/ml, iar pe latex a ajuns doar la 2,2×10⁴celule/ml, [81].

Urmatorul pas a fost cautarea unor substraturi cu microcapsule, cu ajutorul carora sa se studieze in vitro celulele vii, mentinandu-le aceeasi stare morfofunctionala ca in mediul in vivo. Au fost studiate trei tipuri de substraturi: (a) siliciu, (b) strat de Au depus peste Si, (c) sticla, toate cu forme ce mimeaza "cuiburile" in vivo, in care cresc celulele eucariote. In cele 3 substraturi s-au realizat microcavitati de 1-40μm prin tehnici de corodare anizotropa, [83].

Membrana  Citoplasma      Nucleu

Fig.10.16. Comportarea celulelor pe substrat de Siliciu.

S-au folosit masti hexagonale, patrate si circulare pentru creearea unor capsule cu diverse forme. Celulele au fost plasate in cavitati si introduse intr-un incubator, unde au fost alimentate cu nutrienti, astfel incat conditiile lor de viata sa fie cat mai apropiate de cele in vivo. Celulele depuse in aceste mirocavitati au fost celulele fibroblaste dermice, prelevate prin biopsia pielii, [83]. Experientele au demonstrat ca:

- celulele fibroblaste adera bine la toate cele 3 materiale utilizate;

- comportamentul celulelor nu depinde de forma capsulei (haxagonala, circulara, etc.); celulele cauta sa ia forma capsulei;

- comportamentul celulelor in timp a dovedit insa o dependenta de materialul substratului. Cultura de fibroblaste s-a inmultit si a supravietiut cel mai mult pe suportul de sticla;

- prin microscopie optica s-a observat ca histologia (structura) membranara

si citoplasmatica a celulei a fost identica cu cea observata la culturile aflate

pe materialul de referinta "petri dishes";

- tendinta generala a celulelor a fost sa iasa putin din alveole pentru a genera un film coerent peste substrat; in special zona celulei ce continea nucleii se bomba deasupra substratului.

2. Micro si nano instrumente de manevrare celulara

In acest scop au fost imprumutate o serie de dispozitive din diverse domenii si adaptate, miniaturizate pentru scopuri biologice: micropompe cu difuzor/confuzor [77], microdoze, microgrippere mecanice [84], micropipete [85], pulsuri laser pentru aducerea/eliminarea celulelor din microcavitati [86].

Fig. 10.17. Sectiune transversala printr-un microgripper tactil.

Gripperele sunt instrumente de manevrare si asamblare utilizate in tehnica. Microgripperele utilizate in domeniul biologic trebuie sa manipuleze materiale de dimensiuni micronice sau submicronice. In aceste cazuri actuarea se face utilizand forte electrostatice sau piezoelectrice, care erau inutilizabile la scara macroscopica. Adaugand sistemului micromecanic un senzor piezoelectric, ce sesizeaza "atingerea" si eventual o microcamera de luat vederi, se poate obtine un microgripper ca in figura 10.17, care nu numai ca manevreaza microelementele, dar si "pipaie" si "vede", [84]. Principiul de functionare al actuatorului bio-termic se bazeaza pe coeficientii de dilatare diferiti ai aluminiului si siliciului. Cand structura este incalzita consola se incovoaie. Datorita senzorului piezorezistiv incorporat, rezistenta electrica a stratului de siliciu este puternic dependenta de stresul mecanic. Astfel,  forta tactila mecanica este "citita" cu usurinta, gratie unei punti Wheatstone integrata in consola.

De asemenea au fost imprumutate din electrochimie tehnici de separare a unor componente celulare: electroforeza, electroosmoza, dielectroforeza, [87]. Proteinele sunt formatiuni globulare aranjate in asa maniera incat zonele hodrofobe sunt orientate spre interior, iar zonele hidrofile sunt in contact direct cu mediul apos exterior. De asemenea, aranjamentul gruparilor acide si bazice ale proteinei este puternic influentat si de pH-ul mediului exterior, adica de concentratia ionilor de H⁺. Toate aceste considerente duc la modelarea globulara a proteinelor. Lantul proteic are diverse dimensiuni si diverse incarcaturi electrice. Electroforeza proteinelor este influentata de sarcina electrica, de dimensiuni, de solubilitate si de activitatea biologica, fig.10.18.a, [87]. Mobilitatea μ, se defineste similar, ca fiind raportul dintre viteza unui segment proteic v, per intensitatea campului electric aplicat din exterior, E, deducandu-se formula:

µ = v/E = Q/                                                                                    (10.8)

unde se poate constata ca mobilitatea creste cu sarcina globala Q, si scade cu raza r a proteinei globulare, depinzand de asemenea de coeficientul de vascozitate η. Ca aplicatie la acest studiu se poate observa electroforeza Acidului Dezoxiribo Nucleic (ADN) in fig.10.18.b.

 

                                    (a)                                                                    (b)

Fig. 10.18. (a) Electroforeza unui lant proteic este influentata si de incarcatura electrica a segmentelor proteice, dar si de masa lor; (b) exemplu - electroforeza ADN-ului.

Micropipetele sunt alte intrumente clasice miniaturizate, fig.10.19.

Fig. 10.19. Micropipete: (a) de dimensiunea firului de par; (b) pentru manevrari ale organitelor celulare

Pentru a manevra membrana unei celule vii, se utilizeaza o micropipeta ca in fig. 10.19.b. Dupa o incalzire bine controlata a unui tub capilar de sticla sau cuart cu diametrul de aproximativ 1 μm se plaseaza pe membrana. Dupa racire, prin conractia aerului din capilar se poate trage de celula.

Pentru a masura activitatea celulara a celulelor miocite prelevate de la broasca, cercetatorii au utilizat o micropipeta ca in figura 10.20, [87]. Este necesar un contact foarte bun pipeta-celula pentru masuratori corecte (spre exemplu masuratori ale deschiderii canalelor ionofore de pe peretii celulari). Acest contact este obtinut prin suctiune, cand celula miocita (prezentata in stanga) este prinsa de pipeta.

Fig. 10.20. Micropipete ce actioneaza asupra membranei unei celule miocite.