Metode si tehnici folosite in efectuarea examenului micologic
Introducere Definitii si precizari de termeni Termenul generic de fung defineste o grupare de structuri biotice eucariote, imobile, unicelulare sau organizate in structuri pluricelulare, a caror evidentiere individuala necesita dispozitive optice de tipul microscoapelor. In alternativa cu acest termen, dar cu aceeasi semnificatie semantica se utilizeaza si denumirile de micromiceti, ciuperci microscopice, mucegaiuri, drojdii etc. Sa facut aceasta precizare expresa pentru a accentua faptul ca obiectul de studiu al micrologiei medicale sunt ciupercile microscopice, bioentitati capabile sa manifeste o puternica si extinsa acctiune antisanogena, atat prin colonizarea substraturilor alimentare si furajera pe care le depreciaza sau carora le confera un grad inalt de toxicitate, cat si prin afectarea directa a organismelor omului si animalelor, declansand stari morbide specifice (micoze) a caror evolutie este de cele mai multe ori trenanta si rebela la tratament. Ciupercile patogene, desi nu par atat de numeroase ca cele saprobiote, paraziteaza organisme vii – plante, insecte, pesti, reptile, pasari, mamifere, om – provocand boli a caror gravitate depaseste uneori pe aceea cauzate de bacterii sau virusuri. Intre aceste doua categorii de micromiceti exista numeroase forme de trecere, intermediare; unele, considerate ca fiind parazite, pot trai in anumite faze ale dezvoltarii lor ca saprobiote, iar altele, recunoscute ca saprobiote pot deveni in anumite conditii patogene, daca intalnesc o gazda convenabila. Terapia moderna presupune si un diagnostic de certitudine in micoze. 42724fyz68bhs3i In acest scop se utilizeaza mai multe metode de examen paraclinic : testul florescentei; examenul microscopic al probelor patologice; examenul frotiurilor dupa colorare; yh724f2468bhhs insamantarea probelor patogenice pe medii specifice; examenul caracterelor biochimice; examenul histologic; diagnosticul experimental; identificarea AND-ului specific; diagnosticul imunologic. Testul fluorescentei cu lampa Wood Lampa Wood are capacitatea de a emite ultraviolete a caror lungime de unda este cuprinsa intre 330 si 365 nm. Ea este utilizata pentru evidentierea unor dermatofiti ce se gasesc pe parul si pielea animalelor.Metoda este folosita mai des la pisici care pot prezenta un parazitism subclinic cu dermatofiti. Cu 5-10 minute inainte de folosire, lampa Wood se aprinde, pentru a se incalzi, deoarece stabilitatea intensitatii luminii si a lungimii de unda este dependenta de Pag1 temperatura. Animalele de examinat (caini, pisici) se plaseaza in camere obscure, expunand corpul la lumina lampii Wood. Cu lampa Wood pot fi examinate de asemenea tesuturi si fragemente de par recoltate de la aceste animale. In cazul parazitismului cu Microsporum canis si M. equinum se poate observa o fluorescenta galben-verzuie data si pteridina secretatade fungi .Acest metabolit este produs de fungi in momentul invadarii active a firelor de par si nu in cazul infectiei in vitro a parului. Parul trebuie expus 3-5 minute la lumina ultravioleta, unele suse de fungi dand o fluorescenta mai slaba. Speciile genului Trichopyton nu dau fluorescenta parului, cu exceptia lui T. schoenleinii, care prezita patogenitate pentru om dar aceasta este slaba si neregulata; Fluorescenta nu apare in cruste, scuame si in culturile de dermatofiti; Unele stadii de Microsporum nu prezinta fluorescenta sau au o fluorescenta slaba; Fluorescenta scade dupa aplicarea de alcool pe par; Unele preparate medicamentoase (iodate), aplicate anterior pe leziune, pot masca fluorescenta parului. Bacterii precum Pseudomonas aerudinosa si Coriynebacterium minutissimum pot da fluorescenta, dar nu de culoare verzuie precum dermatofitii; False reactii pozitive pot fi date de unele pretarate medicamentoase (tetraciline), de cheratina, sapunuri, petrol, vaselina, par mic, fragmente de unghie. Parul care prezinta fluorescenta se recolteaza pentru insamantare pe medii de cultura si pentru microscopie. Lipsa fluorescentei nu exclude dermatofitia. Tabelul 1 Pag2 Unii autori recomanda examinarea in totalitate a suprafetei corporale a pacientilor intr-un spatiu intunecat, folosind lampa Wood mobila. Prezenta unor zone sau a unor produse biologice fluorescente consituie un prim semnal, in tentativa de a stabili diagnosticul unei microze. Radiatiile UV pot actiona nociv asupra structurilor anatomice ale globului ocular si de asemenea ele pot induce procese mutationale in celulele tinere, aflate in diviziune pe care o pot stimula pana la cote aberante, necontrolate. Din acest motiv, expunerea animalului la radiatiile UV va fii limitata la cateva minute, iar ochii acestuia vor fii protejati. Examinarea in lumina UV, scuamele si perii recoltati de la pacienti cu microsporie evidentiaza fluorescenta albastra-verzuie sau galben-verzuie )Solcan si col,1999).Fluorescenta se datoreste unor mataboliti ai triptofanului elaborati de fungi. Wilkinson (1988) afirma ca tulpinile de Microsporum canis sunt fluorescente in proportie de 50-60%, iar alti autori ( Miler si col,1989; Scott, 1989) mentioneaza ca fluorescenta poate fii intalnita, dar mai rar, si la alte specii. Astfel, culoarea fluorescentei este albastra de diferite nuante pana la verde inchis in cazul speciei Trichophyton schoenleinii si galbena-verzuie cand invectia este produsa de Microsporum audouinii Examenul microscopic direct al probelor patologice
Recoltarea probelor patologice Pentru confirmarea diagnosticului de endo- sau recolteaza probe patologie (puroi, par, scuame, cruste, expectorantii, exudate, fecale, etc.) care fie sunt examinate de cel care recolteaza, fie acestea sunt trimise la un laborator de specialitate. In acest ultim caz, probele patologice recoltate vor fii trimise in cel mai scurt timp la laborator cu o nota de insotire. Acestea trebuie sa cuprinda date privind identificarea aminalului (nume, specie, rasa, varsta), conditiile de viata, contactul cu alte animale, data si locul recoltarii probei, semne clinice si tipul leziunii, eventualele medicamente aplicate si rezultatul obtinut, tipul examenului cetur, diagnosticul prezumtiv. Raclatul cutant se recolteaza cu ajutorul unui bisturiu steril. Raclarea se face de la marginea leziunii, de obicei de pe pielea aparent sanatoasa. Este preferata efectuarea unei raclari profunde pana apare o serozitare roza. O data cu crustele si scuamele se obtin, de obicei, si fragmente de par. Recoltarea se face direct pe lama, dupa ce bisturiul a fost imbibat in lactofenol, daca examinarea are loc instantaneu, sau in eprubete sau recipiente sterile, daca probele vor fi transportate la laborator. Pentru a reduce gradul de contaminare microbiana, inaintea recoltarii, pielea poate fi antiseptizata cu alcool 70%. Recoltarea crustelor si scuamelor poate fi realizata si cu ajutorul unei benzi adezive transparente (schotch) care se ataseaza pe zona cu leziuni.Schotchul se desprinde si se impreuna cu materialul retinut, se aplica pe o lama pe care, in prealabil, s-a pus o picatura de lichid clarificator. Daca lipsesc leziunile (de exemplu in parazitismul cu M.canis la pisica ) se poate practica tehnica Mackenzie care se refera la perierea pielii cu o periuta de dinti sterila.Materialul patologic (scauame si par) este colectat pe o suprafata de hartie Pag3 sau o lama. Scuamele recoltate din locuri diferite ale leziunii vor fi in cantitate suficienta. Recoltarea se va face indeosebi din leziunile aparute mai recent si care nu au fost tratate atimicotic. Din leziunile veziculoase sau buloase se va recolta plafonul veziculei sau al bulei. Probe de par pot fii obtinure prin smulgere atat din centru, cat si de la periferia leziunii. Parul care prezinta fluorescenta, in cazul examinarii cu lampa Wood, reprezinta proba cea mai indicata a se recolta.Smulgerea parului este usor de realizat in cazul parazitismului cu Microsporumdar mult mai dificila in infestatia cu Trichophyton, parul fiind mai scurt,mai rar si mai greu de recoltat chiar si cu ajutorul pensei. In acest caz este preferabila recoltarea parului prin raclare. Unghiile si ghearale se recolteaza cu ajutorul unor clesti speciali, incepand cu locul unde se termina zona sanatoasa. Uneori este necesar sa se sectioneze adanc pentru a recolta partea efectata. Puroiul din abcese sau foliculite se recolteaza cu ajutorul unei seringi sau cu un tampon steril, In primul caz, zona afectata este punctionata, iar in al doilea caz, fie se preseaza zona purulenta pentru exprimarea puroiului, fie se tamponeaza eventual traiect fistulos. Daca nu se examineaza imediat, pentru a nu se usca, in recipientul in care s-a recoltat puroiul se poate adauga putin ser fiziologic steril sau mediu Stuart, dar fara antibiotice. Probele se vor stoca la 4º C. Sputa si mucusul faringeal pot fi obtinute prin aspiratie, fie cu ajutorul unor tampoane sterile. Proba recoltata se introduce in eprubete sterile, ca atare sau imersata cu mediu Stuart pentru a preveni uscarea. Probele se pastreaza la 4º C Secretiile nazale si vaginale se recolteaza cu tampoane sterile ce se introduc apoi in eprubete. Pentru recoltarea secretiilor auriculare, urechea este curatata, iar parul lung este taiat. Secretiile se obtin prin tamponare, avand grija sa se lucreze cat mai steril pentru a nu contamina proba Urina de la animalele vi se recolteaza cu un cateter direct in eprubete sterile, iar de la cadavre cu seringi de unica folosinta. Fecalele se recolteaza din rect si se aplica direct pe lama, cand examinarea are loc imediat, sau pe tampoane ce se introduc in eprubete cu solutie fiziologica si antibiotice, cand examinarea are loc mai tarziu. Inaintea recoltarii laptelui, mameloanele se spala cu apa si se antiseptizeaza. Laptele (cativa mililitri) din fiecare sfert se recolteaza in eprubete sterile, dupa ce primele jeturi sunt inlaturate. Lichidul cerebrospinal se obtine prin punctia lombara, iar sangele prin punctie venoasa. Recoltarea se face cu seringi sterile, iar materialul recoltat se depoziteaza in eprubete sau flacoane sterile. 2) Examinarea probelor patologice recoltate Examenul microscopic direct are drept scop identificarea micetilor in probele patologice recoltate.In urma acestui examen se poate preciza pozivitatea sau negativitatea diagnosticului, iar uneori, si specia de micet (tabelele 2 si 3 ). Pentru evidentierea micetilor in probele recoltate este necesara utilizarea unor solutii clarificatoare. In acest sens se pot utiliza : hidroxidul de sodiu sau potasiu in pag 4 concentratie de 10-30%, cloral- lactofenolul, lactofenolul Amann si sulfura de sodiu in solutie hidroalcolica 10% Cloral lactofenolul are in componenta: cloral hidrat cristalin 20 g; fenol cristalin 10 g; acid lactic 10g; Clarificarea se obtine mai incet insa produce mai putine artefacte, iar preparatul se poate pastra mai mult timp [ 3 ] Lactofenolul Amann este compus din: fenol cristalin 10 g; acid lactic 10 g; glicerina 20 g; apa distilata 10 ml; Se poate adauga si un colorant specific albastru de anilina (bleu cotton) in proportie de 0,5%. Sulfura de sodiu sol.10% : sulfura de sodiu 1 g; alcool pur 2,5 ml; apa distilata 7,5 ml. Se pastreaza in sticle inchise de culoare.Cu aceasta solutie, disocierea se face la rece fara flacara, iar clarificarea se produce mai rapid. De asemenea se pastreaza intacta vizibilitatea raportului dintre tesutul invadat si ciuperca invadanta producand cele mai putine artefacte [ 3 ]. Ca dezavantaj se consemneaza mirosul specific in urma degajari hidrogenului sulfurat. Parul, scuamele, crustele etc. materiale patologice cu consistenta ridicata, vor fi examinate dupa depunere pe o lama intr-o picatura de cloral-lactofenol. Daca nu s-a reusit disocierea, atunci se pot utiliza pentru clarificare solutii mai puternice precum sulfura de sodiu 10% sau hidroxidul de sodiu in concentratie de 10-30%. Examinarea se face imediat, in cazul primei solutii, sau dupa 20-30 minute in ultimele doua situatii. Pentru a grabi clarificarea, in cazul solutiilo NaOH si KOH, se poate practica incalzirea lamelor la o flacara, fara a se ajunge la fierbere. Probele sunt considerate pozitive daca reusim sa evidentiem spori si/sau hife. Parul parazitat este, in general, inconjurat de un manson de spori (ectotrix) sau hifele si/sau sporii se gasesc in interiorul acestuia (endotrix) In crustele si scaumele cutanate pot fi identificate hife, spori, artrospori sau celule levurice rotunde sau ovale. Prezenta in calatul cutanat a unor celule in forma de dop sugereaza infectia cu Malassezia (Pityrosporum). In raclatul cutanat putem identifica, de asemenea spori si elemente fungice ce apartin speciilor: Penicilium, Cladosporium, Aspergillus, Alternaria, Fusarium, Scopulariopsis etc. Materiale patologice recoltate din unghii si gheare necesita un timp mai indelungat pentru clarificare, avand in vedere consistenta lor mai ridicata. Se pot identifica spori, hife si levuri. Unii sunt agenti micotici primari, iar altii s-au grefat pe infectiile existente. Unii miceti, precum Candida, pot avea rolul atat de agenti infectosi primari cat si secundari. Puroiul, sputa mucusul faringeal si secretiile nazale se examineaza dupa clarificare cu hidroxid de potasiu. In preparatele microscopice necolorate se pot evidentia levuri, hife, celule sangvine bacterii. Secretiile auriculare se clarifica cu clorarl-lactofenol sau KOH. La examenul microscopic se identifica bacterii, levuri, spori etc. Uneori se pot identifica fragmente de par cu filamente sau/si spor. La caine si pisici parazitismul cu celule levurice in forma de dop respectiv Malassezia, este frecvent intalnit. Din fecale se fac frotiuri dupa diluare cu apa. Peste lame se aplica lamele si preparatele se examineaza microscopic. Desi acest examen nu are marea valoare pentru diagnostic, totusi indentificarea unor formatiuni micetice ne poate orienta Pag5 spre un diagnostic cultural complementar. La urina se examineaza sedimentul obtinut dupa centrifugare. Lichidul cerebrospinal se centrifugheaza. Cate o picatura din sendiment sau supernatat se examineaza direct la microscop, intre lama si lamela. In cazul infectiei cu Cryptococcus se pot identifica celule rotunde ovale cu muguri. Pag 6 Tabelul 2
Specia de dermatofit Fluorescenta in lumina ultravioleta
Microsporum canis + ( nu toatel susele )
Microsporum equinum +
Microsporum audoinii +
Microsporum gypseum - sau ñ
Microsporum nanum - sau ñ
Trichophyton mentagrophytes -
Trichophyton quinckenum Ñ
Trichophyton simii Ñ
Trichophyton verrucosum -
Trichophyton tonsaurus -
Trichophyton rubrum -
Trichophyton ajelloi -
Trichophyton schoenleini +
