Prof. Carmen Socaciu
Studenti
Belbe Giorgiana, Bogatean Andreea, Bolog Simona,
Coldea Claudia,Contras Monica
Termenul de "antibiotic" este folosit pentru o gama larga de compusi atat naturali cat si semi-sintetici, care au efect antibacterian.
Antibioticele se impart in cinci clase: peniciline, tetracicline, macrolide, aminoglicoze si amfenicoli. Sulfoaminele, nitrofuranii si chinolonele nu sunt antibiotice in adevaratul sens al cuvantului pentru ca sunt sintetice.
Acesti compusi sunt utilizate de multi ani in tratementul bolilor animalelor producatoare de carne, lapte si oua. De asemenea au mai fost folositi si pentru previnerea anumitor boli, dar si pentru accelerarea cresterii.
Pentru protejarea sanatatii consumatorilor Uniunea Europeana a stabilit limite maxime pentru rezidurile de produse medicamentoase in tesuturile animaliere provenite. Aceste limite au se incadreaza intre factori de 10-100 pentru a asigura o hrana lipsita de reziduri nocive.
Anumite antibiotice au fost interzise pentru animalele producatoare de carne, lapte si oua.
La ora actuala exista putine metode capabile sa masoare concentratiile de antibiotice la limitele impuse de UE pentru ca unele antibiotice nu sunt solubile in solventi organici, ceea ce a ingreunat extragerea rezidurilor ti stabilitrea concentatiilor lor din tesuturi. Alte antibiotice nu sunt suficient de volatile sau sunt prea instabile la temperaturi inalte pentru a permite analiza lor folosinr GC sau GC-MS. Astfel multe din metodele de masurare a rezidurilor de antibiotice se bazeaza pe HPLC. Cu toate acestea HPLC nu este o metode suficient de specifica pentrua fi utilizata ca referinta in UE.
Penicilinele (fig 10)-acidul 6-aminoampicilinic sunt administrat animalelor producatoare de carne, lapte si oua din motive terapeutice dar si prolifice. Manipularea catenei laterale fost a modificat spectrul antibacterian al penicilinei pentru a include atat bacteriile gram-pozitive, cat si cele gram-negative.
O gama larga de procedee LC-MS a fost aplicata pentru analiza penicilinei in tesuturi, dar si in lapte. S-au inregistrat metode care folosesc atat ioni pozitivi, cat si ioni negativi. Comparatia acestor metode in ceea ce priveste sensibilitatea este dependenta de instrumentele folosite, dar si de tehnicile de ionizare.
Un numar mare de cercetatori au folosit metoda cu ioni pozitivi. Mecanismul de fragmentare presupune deschiderea inelului β-lactam, urmata de hidratarea si pierderea dioxidului de carbon.
In 1989 Tyczkowska et al. a aplicat LC-MS la penicilina G in laptele de bovina. Laptele a fost diluat cu un volum echivalent de acetonitril-metanol-apa ( 40:20:20, v/v/v) pentru ca proteina sa precipite. Dupa aceea a fost centrifugat. Pentru masurare s-a folosit un spectrometru de masa Finnigan Mat 4800. Sistemul LC consista dintr-un cartus Brownlee Phenyl Spheri-5 cu faza mobila de izopropanol 0.2M, acetat de amoniu si acid acetic ( 12.5:85.5:2, v/v/v). LOD-ul a fost 100 μg/l bazat pe monitorarea ionului [M+H]+ la m/z 335 si [M+H+H2O-CO2]+la m/z 309.
Voyksner et al. a dezvoltat aceasta metoda aplicand-o si pentru cloxacilina, ampicilina si amoxacilina in laptele de bovina. Pentru a optimiza sensibilitatea metodei pentru amoxicilina s-au monitorizat ionii [M+H]+ la m/z 366 si [F+H]+ la m/z 207 datorita abundantei de ioni [M+H+H2O+CO2]+ la 340. LOD-urile au fost estimate la 100, 200, 200 μg/l. in timp ce alti cercetatori au folosit LC-MS pentru confirmare, linearitatea a fost obtinuta cu coeficientii de corelatie de 0.9996. Comparatia facuta intre nivelele de cloxacilina din lapte determinate cu LC-UV si LC-MS a demonstrat apropierea rezultatelor.
LC-MS a fost folosita impreuna cu detectarea UV de Boison et Al. pentru a confirma prezenta penicilinei in lapte. Dupa precipitarea proteinei probele au fost aplicate unui cartus Bond Elut C18 SPE din care penicilinele au fost eluate cu aceto-nitril 0.0125 M si acetat de amoniu (60:40, v/v). Separarea LC a fost obtinuta folosind o coloana Nova-Pak C18 cu faza mobila de acetonitril 0.15 M si acetat de amoniu (10:90, v/v). s-a folosit un spectrometru de masa VG Trio II. Cercetatorii au declarat ca raspunsul penicilinei G m/z 352 cu concentratie de 5 μg/kg a fost slab.
Voyksner si Pack au studiat fragmentarea folosind tehnici electrospray si ionspray cu Cid pentru a reproduce informatia structurala a penicilinei G si cloxacilinei. Fragmente din ionii de [M+H+H2O-CO2]+ nu au fost detectate la electrospray. Cum s-a crescut potentialul, s-au format fragmente de ioni provenite de la inelul β-lactam. La diferemte mai mari depotental s-au format ioni avand valori de m/z sub 100.
Studii echivalente asupra spectrului de ioni negativi folosind Analytica electrospray MS Model 100547-3 conectat la un spectometru de masa Hawlett -Packard 5989A. In general metoda cu ioni negativi a produs semnale cu intensitati mai mici comparativ cu metoda ioni pozitivi. Fragmentarea rezultata din decarboilarea si desfacerea inelului β-lactam, a format ioni [M-H-CO2]- β-lactam la m/z 289 si [F-H-H2O]- la m/z 192 pentru penicilina G.
In concluzie folosirea metodelor LC-MS pentru confirmarea penicilinelor pozitive la LC-UV nu a dat rezultatele corespunzatoare pentru ca nu a intrunit standardele Lod-urilor.
Tetraciclinele (fig 1), deriva din Streptomyces si sunt active impotriva unei game largi de microorganisme gram-pozitive si gram-negative. Actioneaza prin inhibarea biosintezei proteice. Tetraciclinele nu au volatilitatea necesara pentru GC-MS. LC-MS a fost insa aplicata cu succes pentru analiza acestor compusi.
Kijak et al. a dezvoltat o metoda pentru determinarea tetraciclinei, oxitetraciclinei, clortetraciclinei in lapte folosind LC-MS. Un filtrat de lapte a fost pus intr-un cartus C18 SPE, care a fost spalat cu apa si metanol. Rezidul de tetracilina a fost eluat in acid oxalic. Au fost folosite un Hawlett-Packard HP59980A si un spectometru HP 5988A. Faza mobila consista dintr acetonitril 0.05M, acid oxalic si metanol. Metanul a fost folosit ca gaz reactiv. Datele au fost prezentate in concentra tie normala 100μg/l.
In 1997 a fost descoperita o metoda pentru determinarea tetraciclinei, oxitetraciclinei, clortetraciclinei in muschi si rinichi folosind ionizarea chimica la presiune atmosferica LC-MS. Probele au fost extrase in glicina. Dupa aditionarea de sulfat de amoniu, extractul a fost centrifugat, iar supernatanul a fost curatat folosind cartuse de ciclohexil care au fost spalate cu apa si metanol. Tetraciclinele au fost eluate in metanol, uscate si reconstiuite in faza mobila care consta din 20 mM de acid oxalic 10 μg/l si acetonitril. Probele au fost analizate folosind spectrometrul de masa VG Platform II. Pentru fiecare compus ionii monitorizati corespundeau la [M+N]+, [M+N-NH3]+ si [M+N-H2O]+. Faza mobila a permis rezolutia tetraciclinelor. Metoda a fost validat la 50-200 μg/kg din muschi si 300-1200 μg/kg din rinichi. S-a dovedit ca aditia de acid oxalic este necesara pentru a mari rezolutia si forma picurilor.
Oka si colaboratorii au folosit in 1994 FAB (Fast Atom Bombardment) LC-MS pentru analiza tetraciclinei, doxacilinei, oxitetraciclinei, clortetracicli-nei in miere si a tetraciclinei, oxitetraciclinei, clortetraciclinei in ficat, rinichi si muschi de bovina folosind ionizatia electrospray LC-MS-MS cu disociatia cu coliziune indusa. Metoda lor presupunea amestecul probei cu solutie tampon de EDTA-McIlvaine de pH 4.0. amestecul a fost centrifugat si filtrat prin faza solida folosind ubn cartus Bond Elut C18 care a fost preconditionat cu solutie apoasa de EDTA. Rezidul de tetracilina a fost eluat folosind acetat de etil si metanol. Apoi a fost uscat sdizolvat in apa. Separarea a fost facuta folosind o coloana TSK Super Octyl, faza mobila fiind acetonitril 25% in solutie apoasa 0.05% de acid triofloroacetic. Spectrometrul de masa folosit a fost Finnigan TSQ 7000. metoda a fost validata pentru cele patru tetraciline la o concentratie de 100 μg/kg.
In concluzie folosirea LC-MS in analiza rezidurilor de tetracicline a produ trei metode validate la concentratii relevante. LC-MS pare sa ofere si o metoda de a masura si studia izomerii structurali ai clortetraciclinei care sunt imprtanti in determinare continutului de reziduri in alimente.
Macrolidele sunt un grup de compusi care contin 12, 14, 16 inele macrociclice la care sunt atasati amnioglucide sau glucide neutre. (fig 3).
Un singur test LC-MS pentru determinarea rezidurilor a fost dezvoltat pentru fiecare membru din aceasta grupa, cu exceptia jozamicinei; si un test capabil sa detecteze toati cei 5 compusi.
Pleasance et al. a raportat metoda ionspray LC-MS pentru confirmarea eritromicinei A in tesut de somon. O proba din muschi de somon a fost omogenizata de doua ori in acetonitril, centrifugata si apoi fiftrat supernatantul. Filtratele combinate au fost extrase cu hexan pentru indepartarea grasimilor. Acetonitrilul a fost alcalinizat cu hidroxid de natriu. Solutia a fost apoi amestecata cu diclormetan. Dupa aditia de solutie apoasa de Na2 HPO4 amestecul a fost agitat energic. Clorura de sodiu in stare solida a fost aditionata pentru a facilita separarea stratelor apoase de cele organice. Diclormetanul a fost indepartat cu solutie de clorura de sodiu, uscat si rezidurile reconstituite in metanol. La HPLC s-a folosit o coloana de Zorbax Rx-C8, folosind ca eluant solutie apoasa de acetonitril continand si 0.2% acid formic. A fost solosit spectometrul de masa Sciex API III. Folosind LC-MS si LC-MS-MS cu CID, eritromicina a putut fi detecdtata la 0.01 si 0.05 μ/kg. De asemenea au putut fi detectate si un mare numar de metabolite si produsi de degradare.
Cu toate acestea s-a cerut o metoda de curatare pentru ca analiza a doar cateva probe cerea inlocuirea coloanei.
In 1994, Sanders si Delepine, cel mai activ grup in analiza MS a macrolidelor, descriu o metoda LC-MS pentru analiza spiramicinei in muschi de bovina. Spiramicina a fost extrasa din probe de muschi in cloroform. Extactul a fost aplicat intr-un cartus Bond Elut Diol care a fost mai intai spalat cu cloroform. Rezidul de spiramicina a fost mai intai eluat cu acid formic 2% in acetat de amoniu 0.05 M, metanol (35%) si acetonitril (15%). Acest solvent fost in HPLC pentru separarea spiramicinei. El a fost trecut printr-o coloana LiChristophor RP18. a fost folosit un spectometrul de masa Hawlett-Packard 5989 A, folosind ca reactiv metan. Ionul molecular nu a fost prezent din cauza labilitatii spiromicinei, cea mai mare masa moleculara a fost cea a pierderii de apa [M+H-H2O]-. Folosind ionii la m/z 684, 683, 475, 330 si 304 cercetatorii au putut sa valideze concentratii de jumatate, aceleasi si dublu fata de cele cerute de UE la 50 μ/kg de muschi.
In concluzie acest grup de compusi este relativ bine acoperit, cu o metoda capabila sa determine reziduuri amestecate continand toti membii acestui grup la concentratii apropiate de cele stabilite de UE.
Streptomices si Micromonospora produc aminoglicozide. Ele sunt antibiotice cu spectru larg de activitate si sunt formate dintr-un inel aminociclitol (2-deoxistrept amina in cele mai multe cazuri) legat de doua sau mai multe amninoglucide in legatura glicozidica (fig 2). Analiza chimica a aminoglicozidelor a fost intotdeauna un punct slab al analistilor. Acesti comusi prezinta toate proprietatile fizicochimice care ingruneaza metodele de confirmare. Fiind foarte hirdofilice extragerea lor este foarte dificila. Se descompun la temperaturi mari facaand analiza GC sau GC-MS aproape imposibila. Cu toate ca LC-MS ar terbui sa fie o unelta ideala in analiza acestor compusi, pana la data curenta s-au raportat doar doua metode, amandoua folosind ionspray LC-MS.
McLaughlin si Henion au dezvoltat o metoda capabila sa detecteze spectiomicina, higromicina B, streptomicina s dihidrostreptomicina in rinichi de bovina. Solubilitatea slaba a acestor compusi an solventi organici a fost depasita folosind dispersia fazei solide. Proba de rinichi a fost omogenizata cu cianopropil. Dupa punerea intr-un rezervor de extrctie de 8ml, faza solida a fost spalata cu hexan, acetat de etil si metanol. Proba a fost eluata cu apa , apoi cu acid supfuric 0.05 M. S-a folosit o coloana Spherisorb ODS-2, cu o faza mobila consistand din 8% acetonitril cu 10 sau 20 mM de acid pentafloropanic ca reactiv. Proba s-a introdus intr-un aparat Sciex Taga 6000 E cu sursa APCI.
Folosind SIM la m/z 351 pentru spectiomicina, m/z 265 pentru hirgomicina B, m/z 301 pentru streptomicina si m/z 293 pentru dihidrostrrptomicina, aceste antibiotice au putut fi detectate in rinichi de bovina la concentratia de 20 000 μ/kg.
In concluzie, analiza rezidurilor de aminoglicozide folosind spectrometria de masa este imposibil de realizat intr-un laborator obisnuit. Cu toate acestea, combinarea LC-MS-MS si dispersiei fazei solide da posibilitatea de confirmarea a tuturor acestor compusi la standardele impuse de UE.
W.M.A Niessen, A.B. Tinke, J. Cromatogr. A 703 (1995)
P.J. Kijak, M.G. Leadbetter, M.H. THOMAS, e.a. Thompson, Biol. Mass Spect. 20 (1991)
L.G. McLaughlin, J.D. Henion, J. Chromatorg 591 (1992)
S. Pleasance, P. Blay, M.A. Quilliam, J. Cromatogr. 558 (1991)
